黃精多糖體外抗氧化作用及其對小鼠炎癥性腸病的作用研究

薛學彬++房樹華++汪華君

[摘要] 目的 探討黃精多糖（PSP）體外抗氧化作用及其對小鼠炎癥性腸病是否具有保護作用。 方法 體外抗氧化實驗觀察PSP對羥自由基（·OH）的產生、·OH對紅細胞破壞作用及肝勻漿脂質產生是否具有抑制作用；建立小鼠炎癥性腸病模型并給予PSP治療，觀察小鼠疾病活動度積分（DAI）評分，檢測小鼠結腸組織中MDA、SOD、MPO，并應用Western blot對小鼠結腸組織中NF-κB蛋白表達進行測定。 結果 PSP在體外對·OH的產生及·OH對紅細胞破壞具有抑制作用（P<0.01）、抑制肝勻漿脂質過氧化過程（P<0.01），且其體外抗氧化作用具有劑量依賴性（P<0.05～0.01）；與模型組相比，PSP能降低DAI評分（P<0.01）、抑制結腸組織中MDA、MPO產生（P<0.05～0.01），增加SOD含量（P<0.05），并對NF-κB蛋白表達具有抑制作用（P<0.05）。 結論 黃精多糖具有體外抗氧化作用，其對小鼠炎癥性腸病的抑制作用可能是抑制NF-κB通路，通過減少MDA、MPO產生和增加SOD含量實現的。

[關鍵詞] 黃精多糖；炎癥性腸??；體外抗氧化能力；NF-κB通路

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）29-0027-04

Study on the antioxidant effect in vitro of polygonatum sibiricum polysaccharides and its effect on inflammatory bowel disease in mice

XUE Xuebin1 FANG Shuhua2 WANG Huajun3

1.Department of Drug and Equipment， Zhenjiang Second Peoples Hospital in Jiangsu Province， Zhenjiang 212000， China； 2.Department of Pharmacy， Zhenjiang First Peoples Hospital in Jiangsu Province， Zhenjiang 212000， China； 3.Department of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang 212001， China

[Abstract] Objective To investigate the anti-oxidative effects of polygonatum sibiricum polysaccharides（PSP） in vitro and its protective effect on inflammatory bowel disease in mice. Methods In vitro anti-oxidative experiment was carried out to observe the effect of PSP on the generation of hydroxyl radical（·OH）， the effect of ·OH on the destruction of erythrocytes and whether lipid production of liver homogenate had inhibitory effect. The model of mice inflammatory bowel disease was established and was given PSP treatment. Mice disease activity score（DAI） was calculated， MDA， SOD and MPO in colonic tissue of mice were detected， and the expression of NF-κB protein in the colonic tissue of mice was determined. Results PSP showed inhibitory effect on the generation of ·OH in vitro and ·OH showed inhibitory effect on the destruction of erythrocytes（P<0.01）， which inhibited liver homogenate lipid peroxidation process（P<0.01）， and its in vitro anti-oxidant effect was dose-dependent（P<0.05-0.01）. Compared with the model group， PSP can reduce the DAI score（P<0.01）， inhibit the generation of MDA and MPO in colonic tissues（P<0.05-0.01）， and increase the content of SOD（P<0.05）. It also showed inhibitory effect on the NF-κB protein expression（P<0.05）. Conclusion Polygonatum sibiricum polysaccharide has antioxidant effect in vitro. Its inhibitory effect on mice inflammatory bowel disease may be the inhibition pathway of NF-κB， which is achieved by reducing the MDA， MPO production and increasing the SOD content.endprint

[Key words] Polygonatum sibiricum polysaccharides （PSP）； Inflammatory bowel disease； In vitro anti-oxidative ability； NF-κB pathway

近年來，炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）在我國發病率呈明顯增高趨勢。IBD是一種慢性非特異性炎癥，可造成組織損傷和功能障礙[1]。目前，其發病機制尚未完全闡明。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在免疫和炎性反應通路中發揮了重要作用，其在IBD的發生發展中也發揮重要作用[2]。

黃精多糖（polygonatum sibiricum polysaccharide，PSP）是黃精的主要生物活性成分之一，系中藥黃精中主要生物活性物質，具有調節免疫力、抗腫瘤、降脂降糖、改善學習記憶、抗炎抑菌等功效[3-5]。但黃精多糖對IBD的作用尚未見研究報道。

本實驗擬考察黃精多糖體外抗氧化作用，建立小鼠IBD模型，觀察黃精多糖干預后，小鼠結腸中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓過氧化物酶（MPO）和核因子κB（NF-κB）的變化，探討黃精多糖對IBD小鼠是否具有保護作用及其機制，為黃精多糖的藥用價值開發與臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與藥品

雄性昆明小鼠24只，SPF級，18～22 g（大連醫科大學實驗動物中心）；黃精多糖（純度≥90%，南京澤朗醫藥科技有限公司，批號：ZL20160315012）；2，4-二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonic acid，DNBS，山東西亞化學工業有限公司，批號：A91321）BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（江蘇碧云天生物技術研究所）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）（南京建成生物工程研究所）；髓過氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所）；β-actin一抗、NF-κB一抗、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠 IgG-HRP、ECL化學發光檢測試劑盒（武漢三鷹生物技術有限公司），其余試劑均為化學分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精多糖體外抗氧化實驗研究 參照文獻[6-8]，進行PSP體外抗氧化實驗研究。分別采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測黃精多糖對羥自由基（·OH）產生的抑制作用（PSP濃度：20 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL）；硫代巴比妥酸（TBA）法檢測黃精多糖對家兔肝臟脂質過氧化物的抑制作用（PSP濃度：5.65 μg/mL、28.25 μg/mL、56.50 μg/mL、113.00 μg/mL）以及黃精多糖對羥自由基引發家兔紅細胞膜破裂的抑制作用（PSP濃度：5.71 μg/mL、28.57 μg/mL、57.14 μg/mL、114.28 μg/mL）。

1.2.2 黃精多糖對IBD小鼠的作用研究

1.2.2.1 分組與模型制備 參照相關文獻[9，10]，將小鼠分為三組（空白對照組、模型組、PSP給藥組），每組8只，小鼠禁食不禁水24 h后，5%水合氯醛，400 mg/kg，ip，小鼠麻醉后，3.5F導管從肛門插入腸道深約4.5 cm，模型組及PSP給藥組灌注100 μL DNBS/乙醇溶液（含4 mg DNBS的50%乙醇溶液），空白對照組灌注100 μL50%乙醇溶液，倒立15 min，之后將小鼠放入籠中自然蘇醒。1 h后，PSP給藥組小鼠先給予PSP溶液2600 mg/kg灌胃，空白對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，之后，PSP或生理鹽水連續灌胃7 d，每日1次。

1.2.2.2 小鼠疾病活動評估 疾病活動情況的評估觀察小鼠進食、飲水、活動等一般情況，稱量體重，觀察糞便性狀，參照Hamamoto標準，計算各組小鼠疾病活動度積分（disease activity index，DAI）。見表1。

表1 疾病活動度積分評分

注：*正常大便：軟硬適度，成形大便；松散大便：糊狀、半成形大便，但不粘附于肛門；稀便：黏附于肛門、稀水樣便

1.2.2.3 結腸組織MDA、SOD、MPO的檢測 最后一次給藥前禁食不禁水18 h，第7天給藥后1 h，將各組小鼠脫頸處死，打開腹腔，找到回盲部，自回盲腸后端1 cm向下取5～6 cm結腸，PBS沖洗內容物，液氮速凍，-80℃保存，備用。參照MDA、SOD、MPO檢測試劑盒說明書，檢測結腸組織中MDA、SOD、MPO含量。

1.2.2.4 結腸組織NF-κB蛋白表達的檢測 取材方法同上，將結腸組織用Western及IP細胞裂解液后研磨，致組織樣品完全裂解，12 000×g 離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min變性，分裝，-20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，NF-κB一抗（1∶1000）4℃封閉過夜。1∶1000二抗常溫封閉2 h，ECL曝光顯色。

1.3 統計學方法

各組實驗數據應用SPSS 11.5進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，采用One-way ANOVA法進行方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PSP體外抗氧化作用研究

PSP體外抗氧化實驗結果表明，PSP對·OH產生、·OH誘導家兔紅細胞破裂以及家兔肝勻漿脂質過氧化均具有明顯抑制作用（P<0.01），且具有劑量依賴性（P<0.05～0.01）（表2～4、圖1）。endprint

2.2 小鼠疾病活動力評估

經7 d PSP給藥后，記錄各組小鼠體征，計算各組小鼠疾病活動度積分（disease activity index，DAI）并進行比較，可見經DNBS灌腸后，小鼠出現體重減輕，稀便、便血（便隱血）增多，DAI評分升高。與空白對照組DAI評分0分相比，模型組DAI評分[（3.29±0.70）分]明顯升高（P=0.0000），提示小鼠出現明顯結腸炎癥；與模型組相比，PSP給藥組DAI評分[（1.57±0.90）分]顯著降低（P=0.008），提示PSP對小鼠結腸炎癥具有緩解作用。

2.3 各組小鼠結腸組織中MDA、SOD、MPO的測定

經7 d PSP給藥后，取各組小鼠結腸組織，檢測各組小鼠結腸組織中MDA、SOD和MPO含量，結果如表5所示，與空白對照組相比，模型組MDA、MPO明顯增多（P<0.01），SOD含量明顯減少（P<0.01）；與DNBS組相比，PSP給藥組MDA、MPO含量減少（P<0.05～0.01），SOD含量明顯增多（P<0.05）。

2.4 各組小鼠結腸組織中NF-κB蛋白含量測定

經7 d PSP給藥后，取各組小鼠結腸組織，Western-blot檢測小鼠結腸組織中NF-κB蛋白表達，結果如圖2所示，與空白對照組[（12.09±5.31）%]相比，模型組NF-κB表達[（75.45±10.11）%]顯著增多（P=0.005）；與模型組相比，PSP給藥組NF-κB表達顯著減少（P=0.021）。

與空白對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05

圖2 NF-κB蛋白在小鼠結腸中的表達（x±s，n=8）

3 討論

2，4-二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonic acid，DNBS）是一種半抗原物質，乙醇溶解腸黏膜表面的黏液，破壞腸黏膜屏障，使TNBS與腸道蛋白結合后成完全抗原，引起腸黏膜的免疫反應，誘發結腸炎的發生。其發病機制、病理特點及臨床表現均與炎癥性腸病相似，因此在對IBD治療藥物篩選與研究時，常用于動物模型的制備。

已有研究表明，氧化應激損傷與IBD動物模型和IBD患者發病及疾病嚴重程度具有明顯相關性[11-15]。破壞結腸黏膜屏障功能、促進炎癥介質釋放、腸黏膜組織內免疫調節紊亂等，同時炎癥介質的釋放也會進一步加重氧化應激損傷。因此將具有抗氧化作用藥物應用于IBD的治療也是IBD藥物治療與研發的新途徑與新熱點。本實驗第一部分研究結果表明，PSP在體外對·OH的產生及·OH對紅細胞破壞具有抑制作用（P<0.01）、抑制肝勻漿脂質過氧化過程（P<0.01），且其體外抗氧化作用具有劑量依賴性（P<0.05～0.01），提示PSP在體外具有良好的抗氧化活性，為其應用于IBD的治療提供理論支持與實驗依據。

正常情況下機體內活性氧簇（ROS）的產生與抗氧化保護機制處于平衡狀態。IBD患者腸黏膜層和黏膜下層中吞噬細胞大量增加，導致耗氧量增肌，引起黏膜細胞脂質過氧化損傷，同時生成具有更高活性的羥自由基（·OH），進一步破壞腸道黏膜組織[16]。丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應的重要產物，能引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合而失去活性，同時具有細胞毒性，能使腸黏膜組織損害進一步加重。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的首要物質，其在體內水平的高低是機體抗氧化作用能力的重要體現。MDA與SOD是評價組織氧化損傷的重要指標，其含量反映了組織中過氧化損傷程度與抗氧化能力的高低。MPO是一種催化過氧化物還原的酶，是中性粒細胞和單核細胞氧依賴性殺菌系統的重要組分，同時也是氧化應激的一個主要標志物，可以催化產生次氯酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等氧化產物。MPO水平與中性粒細胞激活程度具有顯著的相關性。MPO在結腸中的活性與組織中中性粒細胞浸潤程度呈線性相關[17]。當細胞MPO水平升高時，可促進炎癥效應細胞的增殖與活化，使效應細胞更易于穿越內皮屏障到達局部炎癥組織，可進一歩導致結腸炎癥的形成[18]。

本實驗結果表明，與空白對照組相比，模型組結腸組織MDA、MPO顯著增多（P<0.01），SOD含量顯著下降（P<0.01），提示在小鼠IBD模型中，結腸組織出現了明顯的氧化應激與炎癥反應。與模型組相比，PSP給藥組能降低DAI評分（P<0.01）、抑制結腸組織中MDA、MPO產生（P<0.05～0.01），增加SOD含量（P<0.05），提示PSP能緩解IBD結腸炎癥反應，可能是通過降低結腸氧化應激損傷與炎癥反應，提高結腸組織抗氧化能力實現的。

NF-κB是多條氧化應激與炎癥信號通路中一個重要的匯聚點，是許多炎癥介質在基因水平的重要轉錄調節因子。已有研究結果表明，在IBD動物模型和患者中，NF-κB可以調節與IBD相關的促炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、IL-6及IL-12等的釋放，加重腸道的炎性反應；提示NF-κB的激活在調節IBD的免疫及炎性反應中起著關鍵作用[19-20]。當結腸受到炎癥或內毒素等刺激侵襲后，NF-κB被激活后從細胞質轉位到細胞核，促進炎癥介質MPO、TNF-α等的表達[21]。NF-κB與IBD的病變程度呈現明顯相關性，因此尋找NF-κB抑制劑也成為治療IBD的新熱點。本實驗結果表明，與模型組相比，PSP給藥組對NF-κB蛋白表達具有抑制作用（P<0.05），提示PSP可能會通過NF-κB通路減少氧化應激損傷與結腸炎癥反應。

綜上所述，本實驗研究發現黃精多糖具有體外抗氧化作用，其對小鼠炎癥性腸病的抑制作用可能是通過抑制NF-κB通路，減少MDA、MPO產生，增加SOD含量，減少結腸氧化損傷，提高結腸抗氧化能力，減輕腸道炎癥反應實現的。本實驗的發現為黃精多糖藥理作用的進一步開發與研究及未來臨床應用提供理論支持。endprint

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（收稿日期：2017-08-31）endprint