不同間歇低氧頻率對大鼠血壓以及血管內皮功能的影響

林慧　陳一和　夏曉東

[摘要] 目的 觀察不同頻率間歇低氧對大鼠血壓的影響及其血管內皮功能的變化。 方法 將40只Wistar雄性大鼠隨機分為常氧對照組（NC組）及4個間歇低氧組（IH1，IH2，IH3，IH4），其低氧頻率分別為10次/h、20次/h、30次/h、40次/h。測定實驗前后大鼠動脈收縮壓、血清內皮素-1、一氧化氮水平。 結果 ①各組大鼠實驗前SBP比較差異無統計學意義。6周實驗結束后，各 IH組SBP較實驗前和NC組均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；隨著間歇低氧頻率的增加，各IH組大鼠血壓逐漸升高，但IH4組較IH3組比較差異無統計學意義。NC組SBP較實驗前差異無統計學意義。②各IH組血清ET-1水平較NC組相比明顯增高（P<0.05），血清NO水平顯著降低（P均<0.01）。隨著間歇低氧頻率的增加，血清ET-1水平升高，NO水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。IH4組與IH3組相比，各指標差異無統計學意義。結論 血管內皮功能障礙在慢性間歇低氧致高血壓過程中起著重要的作用。隨著間歇低氧頻率增高，血壓升高及內皮損傷加重，但并非頻率越高，損傷越重。

[關鍵詞] 阻塞性睡眠呼吸暫停；血壓；內皮功能；間歇低氧頻率

[中圖分類號] R544.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）29-0031-04

Effects of different intermittent hypoxia frequency on blood pressure and vascular endothelial function in rats

LIN Hui1 CHEN Yihe2 XIA Xiaodong1

1.Department of Respiratory Medicine， the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Cardiovascular Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To observe the effect of intermittent hypoxia with different frequencies on blood pressure and the changes of vascular endothelial function in rats. Methods 40 Wistar male rats were randomly divided into normoxic control group（NC group） and 4 intermittent hypoxia group（IH1， IH2， IH3， IH4）. The frequency of hypoxia was 10 times/h， 20 times/h， 30 times/h， and 40 times/h. The arterial systolic blood pressure， serum endothelin-1 and nitric oxide levels were measured before and after the experiment. Results （1）There were no statistically significant differences in SBP between the two groups before the experiment. After 6 weeks of experiment， SBP in each IH group was significantly higher than that before experiment and that in NC group（P<0.05 or P<0.01）； with the increase of intermittent hypoxia frequency， the blood pressure of each IH group of rats was increased gradually， but there was no statistically significant difference between IH4 group and IH3 group. SBP in NC group was not statistically significant compared with that before experiment. （2） Compared with NC group， the levels of serum ET-1 in each IH group were significantly higher（P<0.05）. Serum NO level was significantly decreased（all P<0.01）. With the increase of intermittent hypoxia frequency， serum ET-1 level was increased， and NO level was significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）. There was no statistically significant difference in each index between IH4 group and IH3 group. Conclusion Vascular endothelial dysfunction plays an important role in the process of hypertension caused by chronic intermittent hypoxia. With the increase of intermittent hypoxia frequency， the blood pressure is increased and the endothelial injury becomes severe. But it is not the case that the higher the frequency， the more severe the injuryendprint

[Key words] Obstructive sleep apnea； Blood pressure； Endothelial function； Intermittent hypoxia frequency

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，可以導致OSAS患者各系統損傷，尤其是心血管系統[1，2]。文獻表明，OSAS與高血壓有很強的相關性，是高血壓發生的獨立危險因素之一[3，4]。不斷有研究證明OSAS患者夜間頻繁的間歇低氧血癥可導致血管內皮功能障礙，從而引起OSAS合并高血壓的發生[5]。關于不同間歇低氧程度和間歇低氧持續時間對大鼠高血壓的嚴重程度影響已有文獻報道，但動物模型方面有關低氧頻率的研究較少。因此我們通過建立OSAS模式不同頻率間歇低氧（intermittent hypoxia，IH）大鼠模型，測定鼠尾動脈收縮壓（systolic arterial pressure，SBP）以及大鼠血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮素-1（endothelin-1，ET-1），探討睡眠呼吸暫停模式不同頻率間歇低氧下大鼠血管內皮功能的變化以及對血壓的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性Wistar大鼠40只，合格證號：SCXK-（軍）2009-003，體重（202±15）g。給予普通飼料喂養。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 按照隨機排列表法，將大鼠分為5組，每組8只，分別為NC組（常氧對照組）及IH1組、IH2組、IH3組、IH4組，其間歇低氧頻率分別為10次/h、20次/h、30次/h、40次/h。

1.2.2 模型制作 建立OSAS模式間歇低氧模型，將各組大鼠置于自制的相同密閉低氧艙，通過電腦控制程序設定壓縮空氣和氮氣的釋放時間及流量，使低氧艙內氧氣濃度循環維持在5%～21%，達到預置的低氧/復氧條件。即首先低氧艙內充入純氮氣 30 s，使艙內氧濃度降至最低5%，隨后充入壓縮空氣（IH1：330 s，IH2：150 s，IH3：90 s，IH4：60 s），使艙內氧濃度從低氧狀態5%恢復至 21%。NC組艙內氧濃度始終維持在21%。每日低氧暴露時間為9：00～17：00，共6周。其余時間自由攝食，實驗過程中無大鼠死亡。

1.2.3 大鼠血壓測定 應用無創鼠尾動脈血壓儀測量大鼠SBP，分別于實驗開始前1 d早晨8：00、實驗結束后第2天早晨8：00測量收縮壓。連續測量三次取平均值。儀器BP-6，購自成都泰盟科技有限公司。

1.2.4 血清標本采集及各指標測定 于6周實驗結束后采取大鼠動脈血，4 000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃保存待測。血清ET-測定采用酶聯免疫吸附試驗（ELI SA），血清NO測定采用硝酸還原酶法，試劑盒分別購于R&D公司（Rndsystems，美國）和南京建成生物工程研究所。按試劑盒說明書進行操作。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件處理結果，計量資料以（x±s）表示。各組間采用單因素方差分析檢驗（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD。采用配對t檢驗，相關性分析采用Pearson方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同頻率間歇低氧暴露后大鼠血壓變化

實驗前各組大鼠SBP比較差異無統計學意義（P>0.05）。至6周實驗結束后，IH1、IH2、IH3、IH4組SBP較實驗前SBP和NC組顯著升高（P<0.05或<0.01）；與IH1組相比，IH3、IH4組SBP升高差異有統計學意義（P<0.05）；IH4組較IH3組比較無統計學意義。NC組SBP較實驗前差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2不同頻率間歇低氧暴露后大鼠血清ET-1及NO水平

各IH組與NC組相比，血清ET-1水平顯著增高，NO水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。IH3、IH4組ET-1水平顯著高于IH1組，NO水平低于IH1組和IH2組（P<0.05或P<0.01）。IH4組與IH3組相比，ET-1及NO水平差異無統計學意義。見表2。

3 討論

OSAS與高血壓病在臨床上有著較高比例的共存率[6]。在高血壓等心血管疾病的發生過程中，機制較多[7]，但血管內皮損傷是其最基礎的病理變化[8]。而在OSAS患者特有的慢性間歇低氧條件下，可以出現血管內皮收縮功能增強，舒張功能減弱[9，10]，血管活性收縮物質代謝失衡[11]，從而出現血管內皮功能障礙。因此，血管內皮功能障礙在OSAS患者高血壓發生發展過程中發揮著潛在的重要作用。

NO和ET-1分別起著舒張和收縮血管的作用，兩者在血管中處于動態平衡的狀態，有效調節了血管舒縮功能。NO是由一氧化氮合酶（NOS）催化生成，研究發現低氧造成內皮細胞eNOS不僅合成減少，并且活性降低。另外由于底物O2也減少，故NO的生成減少[12]。OSAS患者反復缺氧可導致內皮細胞生成NO減少，而生成ET-1增加[5]。目前已廣泛應用通過檢測上述血漿中內皮細胞功能標志物來間接反映血管內皮功能。

本研究發現，隨著間歇低氧暴露時間的延長，各IH組大鼠SBP至6周實驗結束時，明顯高于實驗前自身血壓和NC組，而NC組血壓沒有升高，說明由OSAS模式的間歇低氧暴露可以引起大鼠血壓明顯升高，提示OSAS特有的間歇低氧可能是造成血壓升高的根本原因。與NC組比較，IH組大鼠血清中ET-1水平顯著升高，而NO水平呈現下降，這與國內外的文獻報道一致[13-14]。該結果也進一步提示了血管活性物質的改變，在OSAS引起血管內皮功能障礙、高血壓發病過程中起著重要的作用。內皮功能障礙是“內皮-高血壓-心血管事件”鏈的始動因子和載體，慢性間歇低氧可以引起血管內皮受損，導致高血壓，而長期的高血壓對血管壁的剪切力同樣可以加重血管內皮損傷，長期惡性循環，嚴重影響全身心腦血管系統。endprint

另外，我們還監測了不同頻率慢性間歇低氧對大鼠高血壓以及血管內皮功能的影響。Lavie P等[15]曾報道OSAS患者血壓升高的程度與呼吸暫停低通氣指數（AHI）呈正相關，研究結果顯示，OSAS患者AHI每增多1次，高血壓發生的概率就增加1%。本研究也發現，隨著間歇低氧頻率的增加，血壓有升高趨勢，但IH4組與IH3組相比沒有統計學差異。同樣，隨著低氧頻率的增加，ET-1水平逐漸增高，因此間歇低氧頻率可以影響ET-1水平。臨床上AHI用來評估患者睡眠呼吸暫停低通氣嚴重程度，有文獻表明[16]，中重度組OSAS患者血清ET-1明顯升高，而輕度組的患者ET-1并沒有升高。這與我們的課題研究結果類似。同樣，高IH頻率組NO水平明顯低于低IH頻率組，這說明血管內皮舒張功能受損程度隨著頻率增加而損傷加重。但是，研究結果發現， IH4組ET-1水平高于IH3組，而NO水平下降，但兩組沒有統計學意義。與本次研究血壓測得的結果一致。有研究說明[17]，間歇低氧-再氧合對細胞炎性損傷，產生于再氧合階段而非間歇低氧階段。因此分析原因可能為頻率的增加使再氧合時間縮短，不足以再持續性地加重內皮功能損傷[18]。另一原因，過高的呼吸暫停頻率患者與低頻率者相比，前者相對持續地處于低氧狀態，呼吸暫停后難以達到正常氧水平，影響血氧變化的幅度，可能減少內皮功能障礙的程度，故血壓沒有進一步升高。一項多中心研究納入國內20家醫院共2297例患者，進行關于AHI與高血壓患病率的研究[19]結果顯現了同樣的趨勢，隨AHI增加，OSAS患者的高血壓患病率增高，但當AHI達到（66～70）次/h，OSAS患者高血壓患病率達到峰值，而后出現逐漸下降的趨勢。該多中心研究樣本量大，但該研究并未對高血壓產生的機制如血管內皮功能進行檢測。因此我們不排除在更高IH頻率或更長的間歇低氧條件下，大鼠血壓出現下降以及內皮功能損傷減輕的情況，這還需要在以后的實驗中加以驗證。也有研究表明，AHI并不能完全反映低氧的程度，不能評估間歇低氧對內皮損傷及高血壓的影響[20]。

綜上所述，血管內皮功能障礙在慢性間歇低氧致高血壓過程中起著重要作用。隨著間歇低氧頻率增高，血壓升高及內皮損傷加重，但并非頻率越高，損傷越重。因此仍需大規模的臨床研究進一步展現持續增高的低氧頻率與血壓及相關機制的影響。

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（收稿日期：2017-05-20）endprint