幾丁聚糖聚合度的測定方法

張一帆

(鄭州蘭博爾科技有限公司，河南 鄭州 450000)

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幾丁聚糖聚合度的測定方法

張一帆

(鄭州蘭博爾科技有限公司，河南 鄭州 450000)

介紹了以50%乙腈溶液分別溶解稀釋殼寡糖單體標(biāo)準(zhǔn)品及檢測樣，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，分別得到殼寡糖標(biāo)樣溶液和檢測溶液，采用高效液相色譜測定兩溶液的幾丁聚糖聚合度。根據(jù)色譜峰保留時間定性分析；根據(jù)峰面積定量計算得各單體的含量之和，即為幾丁聚糖的含量；根據(jù)聚合度為i的幾丁聚糖單體含量占幾丁聚糖總含量的比值，來考察樣品的聚合度分布情況。通過標(biāo)準(zhǔn)樣與檢測樣對比分析結(jié)果可知，該方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度良好、精確度良好、線性關(guān)系良好、操作簡便等特點，適用于實際生產(chǎn)過程中對產(chǎn)品幾丁聚糖聚合度的檢測。

幾丁聚糖 ; 聚合度 ; 高效液相色譜

0 前言

由于化學(xué)殺菌劑長期使用和使用劑量的逐年增大，病原微生物的抗藥性越來越強，為了降低抗藥性，增強植物的抗病害能力，細(xì)胞活化型抗性誘導(dǎo)劑生物制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛，幾丁聚糖就是其中之一。幾丁聚糖又名殼多糖、殼聚糖、甲殼素、海力源等，是從蟹、蝦殼中應(yīng)用遺傳基因工程提取的動物性高分子纖維素，被科學(xué)界譽之為“第六生命要素”。幾丁聚糖水劑為誘導(dǎo)活性強、對人畜無毒、對環(huán)境無污染、生產(chǎn)工藝簡單和有雙重功能的新一代生物制劑，它可以增強作物抵御病害的能力，增強作物抵御低溫干旱的能力，對環(huán)境友好。

目前在國內(nèi)登記的幾丁聚糖劑型有水劑、懸浮種衣劑、可濕性粉劑、顆粒劑、懸浮劑、水乳劑等幾種劑型，可用于水稻稻瘟病的防治，可以調(diào)節(jié)冬小麥、春大豆、棉花、玉米的生長，防治黃瓜、萵苣的霜霉病、白粉病、根結(jié)線蟲病等，還可以防治番茄的晚疫病、柑橘的炭疽病，對蘋果樹的斑點落葉病也有效果，在作物的病蟲害防治中應(yīng)用廣泛。經(jīng)查詢農(nóng)藥電子手冊，幾丁聚糖毒性為：急性經(jīng)口LD50gt;4 640 mg/kg，急性經(jīng)皮LD50gt;2 150 mg/kg；毒性為低毒。

聚合度是考察幾丁聚糖聚合情況的指標(biāo)，不同聚合度范圍的幾丁聚糖殺菌效果不同。聚合度測定有比旋光度法、超離心法、高壓電泳法、凝膠色譜法，這四種方法誤差較大或者操作繁瑣，往往采用兩種方法測定得出相同結(jié)論才能確定其聚合度。采用高效液相色譜法對聚合度分布情況進(jìn)行測定，準(zhǔn)確度較高。具體方法為：試樣用50%乙腈溶解后，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾，采用親水鍵合色譜測定，根據(jù)色譜峰保留時間定性，根據(jù)峰面積定量，各單體的含量之和為幾丁聚糖的含量。根據(jù)聚合度為i的幾丁聚糖單體含量占幾丁聚糖總含量的比值，來考察樣品的聚合度分布情況。

1 實驗部分

1.1儀器和試劑

高效液相色譜儀：附蒸發(fā)光散射檢測器；色譜工作站；色譜柱： 250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)填Click Maltose 色譜柱填充物；過濾器：濾膜孔徑為0.22 μm；微量進(jìn)樣器：50 μL；電子天平。

水：符合GB/T 6682一級水的要求；50%乙腈溶液：量取500 mL乙腈加水稀釋至1 000 mL；緩沖液：甲酸—甲酸銨，pH值為3.1，100 mmol/L；幾丁聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：氨基葡萄糖鹽酸鹽(≥99%)、殼二糖(≥98%)、殼三糖(≥96%)、殼四糖(≥97%)、殼五糖(≥90%)、殼六糖(≥80%)、殼七糖(≥85%)。

1.2高效液相色譜操作條件

流動相為乙腈—水(體積比為1∶1，甲酸—甲酸銨調(diào)節(jié)pH值3.1)，乙腈梯度洗脫，具體如表1所示。

表1 乙腈梯度洗脫表

流速1.000 mL/min；色譜柱溫度為30 ℃；檢測器：蒸發(fā)光散射(ELSD)；檢測器溫度：80 ℃；檢測器通氣量：1.5 L/min；進(jìn)樣量：20 μL。殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖示意圖見圖1，聚合度測定結(jié)果見圖2。

圖1 殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖示意圖

圖2 聚合度測定結(jié)果

圖2中標(biāo)注的2～15，為聚合度。聚合度為2～7的峰與標(biāo)準(zhǔn)品特征峰基本一致，即可判定樣品中含有幾丁聚糖。

2 測定步驟

2.1殼寡糖標(biāo)樣溶液的配制

分別稱取殼寡糖單體標(biāo)準(zhǔn)品約0.05 g(精確到0.001 g)，加50%的乙腈溶液溶解并稀釋至100 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液備用。

2.2試樣溶液的配制

稱取試樣約0.5 g(精確到0.001 g)，加50%的乙腈溶液溶解并稀釋至100 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液備用。

2.3測定

在上述色譜條件下將殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜分析，測定各標(biāo)準(zhǔn)品組分的色譜保留時間，取20 μL試樣溶液注入高效液相色譜儀分析，測定各個組分保留時間和色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對照，對每一個色譜峰進(jìn)行歸屬。

2.4結(jié)果計算

幾丁聚糖的聚合度(以幾丁聚糖單體的含量計)X2按式(1)計算：

(1)

3 結(jié)果與討論

3.1線性關(guān)系曲線的測定

按照上文“殼寡糖標(biāo)樣溶液的配制方法”，配制5個不同濃度的殼寡糖單體的標(biāo)樣溶液，在上述液相色譜操作條件下進(jìn)行分析，每個標(biāo)樣溶液進(jìn)樣兩次。殼寡糖單體標(biāo)樣質(zhì)量表示為m，殼寡糖單體峰面積(以殼七糖計)表示為R，其結(jié)果如表2所示。

表2 聚合度測定線性關(guān)系測定結(jié)果

以m為橫坐標(biāo)，R(R1、R2平均值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

圖3 聚合度測定的線性關(guān)系圖

從線性關(guān)系圖可以看出線性關(guān)系較好，回歸方程為：Y=118 446 012.6X+37 056，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

3.2準(zhǔn)確度的測定

向已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣中加入一定量的殼寡糖單體標(biāo)樣，測定加入標(biāo)樣量，計算其回收率，試驗結(jié)果見表3，由表3可見該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 聚合度測定準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

3.3精密度的測定

在上述分析條件下，對同一樣品分別進(jìn)行5次平行測定，幾丁聚糖聚合度(以i=7的含量計)分別為14.52%、14.60%、14.83%、14.71%、14.68%，平均值為14.67%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.117，變異系數(shù)為0.79%，由測定結(jié)果可知該方法具有良好的精密度。

3.4與凝膠色譜法測定聚合度的比較

凝膠色譜法是采用凝膠色譜柱，以KH2PO4緩沖溶液為流動相，示差折光檢測器檢測，以殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線作參照，測得幾丁聚糖的重均相對分子質(zhì)量，然后計算聚合度。

凝膠色譜法所用試劑：殼寡糖(不同的相對分子質(zhì)量)、硫酸、鹽酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、EDTA、無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、KH2PO4。樣品需要進(jìn)行如下純化過程：

原料→稱重→熱水抽提→離心→醇沉→離心→濃縮→除蛋白→脫色→透析→過DEAE纖維素柱→水洗脫→凍干→幾丁聚糖L1。做平行試驗，得幾丁聚糖L2。幾丁聚糖聚合度的計算方法為：幾丁聚糖聚合度=幾丁聚糖重均相對分子質(zhì)量/幾丁聚糖中糖最小單元相對分子質(zhì)量。

對同一樣品用兩種方法進(jìn)行檢測，用凝膠色譜法測定的聚合度的兩次分析結(jié)果分別為9.2和9.7；用液相色譜法測定的兩次分析結(jié)果分別為：i=7，14.5%、14.8%；i=8，26.1%、26.5%；i=9，17.8%、17.5%；i=10，12.5%、12.1%。

由以上分析過程和分析結(jié)果可以看出，使用高效液相色譜法操作簡單，更能準(zhǔn)確直觀地得知不同聚合度的幾丁聚糖在產(chǎn)品中所占的比例。而凝膠色譜法要經(jīng)過復(fù)雜的處理過程，是用相對分子質(zhì)量的平均值與最小值的對比來表示聚合度，只是一個大概數(shù)值。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜測定標(biāo)準(zhǔn)樣與測試樣的幾丁聚糖聚合度，對比分析兩者結(jié)果，表明該檢測方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度良好、精確度良好、線性關(guān)系良好、操作簡便等特點。在實際生產(chǎn)過程中可以起到指導(dǎo)作用，可以準(zhǔn)確把控產(chǎn)品質(zhì)量，是分析幾丁聚糖聚合度的較為適用的方法。

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2017-07-14

張一帆(1988-)，女，助理工程師，從事農(nóng)藥方面的研究工作，電話：15090757582。