二倍體棉花熱激轉錄因子HSFs家族全基因組生物信息學分析

張華崇+閆振華+趙樹琪+黃曉莉+戴寶生+李蔚

摘要：熱激因子（heat shock factors，HSFs）是生物體內調節熱激應答的一類轉錄因子，在熱脅迫信號轉導和耐熱性的產生過程中發揮了重要的作用。從已釋放的二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉全基因組測序結果中分別鑒定到42個和40個HSFs蛋白家族成員，運用生物信息學分析其序列特征、亞細胞定位、聚類分析和保守基序等。結果表明，亞洲棉HSFs蛋白長度116～526個氨基酸，分子量13 748.4～60 028.2 u，等電點4.40～8.75；雷蒙德氏棉HSFs蛋白長度為190～528個氨基酸，分子量21 993.0～60 413.6 u，等電點4.36～9.50。染色體定位顯示二倍體棉花中的HSFs基因不均勻分布在13條染色體上；聚類分析表明，HSFs蛋白序列分為A、B、C 3類，每一亞類中二倍體棉花與擬南芥的蛋白具有較高的同源性，趨向于聚集在一起，且每個亞組具有相同或相似的保守基序類型及排列順序。

關鍵詞：二倍體棉花；熱激轉錄因子；全基因組；生物信息學

中圖分類號： Q755 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0035-08

熱激因子（heat shock factors，HSFs）是生物體內調節熱激應答的一類轉錄因子，在熱脅迫信號轉導和耐熱性的產生過程中發揮了重要的作用[1-2]。1988年，HSFs基因首先在酵母中發現[3]，植物中的HSFs基因最先在番茄中克隆獲得[4]。典型的熱激轉錄因子一般包括4個部分：N端的DNA結合域（DNA binding domain，DBD）、寡聚化結構域（HR-A/B）、細胞核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）、細胞核輸出信號（Nuclear export signal，NES），少數還具有一個C端激活域（Cterminal activation domain，CTAD）[5]。位于HSFs基因N端的DBD中含有一個螺旋-轉角-螺旋的疏水結構，能特異地結合熱激元件（heat stress element，HSE），誘導下游熱激蛋白表達[6-7]。HR-A/B含有2個疏水七肽重復區域A和B，通過形成卷曲螺旋結構促使HSFs形成同源三聚體，根據保守DBD和HR-A/B區的結構特點，熱激轉錄因子又可以分為A、B、C 3類[8-9]，在A 類、C類基因中，HR-A/B中A、B結構域之間分別有21個和7個氨基酸插入；在B類基因中，無氨基酸殘基插入[6，10]。NLS和NES含有一簇堿性氨基酸殘基，與HSFs蛋白家族的亞細胞定位相關[11-12]。CTAD以芳族的、大的疏水的及酸性的氨基酸（AHA）基元為特征，在A類基因中含特有激活HSFs功能的AHA基元[6]。

棉花是喜溫植物，適當高溫可加快棉株生長發育，但長時間的高溫嚴重影響花粉發育、授粉和受精，對棉花產量和品質產生不利的影響。隨著全球氣候的變暖，棉花的耐高溫育種顯得尤其重要。本研究利用已釋放的二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉全基因組測序結果[13-14]，通過生物信息學技術掃描全基因組HSFs，進一步分析其進化關系、亞細胞定位、理化性質預測和保守基序等，為下一步的選育耐高溫新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 全基因組檢索HSF基因

HSF基因的結構域信息（PF00447）下載自Pfam數據庫[15]，利用軟件HMMER3.1b2[16]在Cottongen（https：//www.cottongen.org/）數據庫中檢索二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉HSFs基因家族氨基酸序列，經Smart網站[17]（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）進一步結構域預測確認。

擬南芥HSF基因家族氨基酸序列來自PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數據庫[18]。

1.2 理化性質預測

通過ExPASy網站中的程序Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對HSFs蛋白家族蛋白分子量、等電點等基本理化性質進行預測分析。

1.3 亞細胞定位

利用在線軟件WOLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html），以及在線網站Soft Berry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）中的PROTCOMP 程序共同對HSFs蛋白家族進行亞細胞定位預測分析。

1.4 聚類分析

利用生物信息學軟件MEGA5.2對鑒定的二倍體棉花中的HSFs蛋白家族和擬南芥中的HSFs蛋白家族進行多重序列比對，采用鄰接法構建系統發育樹，進行1 000次重復。

1.5 基序分析

利用MEME軟件分析HSFs蛋白家族的motif類型和順序。具體參數設置如下：預測數10，其他參數為默認。

2 結果與分析

2.1 棉花HSF基因家族鑒定

利用結構域預測得到的結構域信息（PF00447），通過對二倍體棉花全基因組搜索，發現亞洲棉和雷蒙德氏棉分別有42條和40條具有典型HSF結構域蛋白，并統計了其蛋白號、蛋白長度及對應基因所在的染色體（表1），結果顯示，亞洲棉HSFs蛋白長度為116～526個氨基酸不等；雷蒙德氏棉HSFs蛋白長度為190～528個氨基酸不等。亞洲棉基因組中的42個HSFs基因家族成員不均勻分布在13條染色體上，其中，A11號染色體分布最多，為8個；A6號染色體分布最少，為1個。雷蒙德氏棉基因組中的40個HSFs基因家族成員也不均勻分布在13條染色體上，其中，D3、D4和D6號染色體分布最多，均為5個；D1、D2和D12號染色體分布最少，均為1個。endprint

2.2 棉花HSFs蛋白家族理化性質預測

利用在線網站對二倍體棉花HSFs蛋白家族理化性質進行了預測（表1），預測結果，二倍體棉花中HSFs蛋白分子量存在較大差異。其中，亞洲棉中分子量最大的是Cotton_A_14557，達到了60 028.2 u，分子量最小的是Cotton_A_24993，為13 748.4 u；雷蒙德氏棉中分子量最大的是Gorai.004G284200，為60 413.6 u，分子量最小的是Gorai.006G087100，為21 993.0 u。等電點變化范圍也比較大，其中，亞洲棉中Cotton_A_01784等電點最大，為8.75，Cotton_A_00864最小，為4.40；雷蒙德氏棉中Gorai.006G125000等電點最大，為9.50，Gorai.008G170800最小，為4.36，表明HSFs蛋白家族從酸性到堿性都有分布。

2.3 棉花HSFs蛋白家族亞細胞定位

為了了解HSFs蛋白家族發揮功能的區域，利用2種亞細胞定位軟件預測了二倍體棉花HSFs蛋白家族亞細胞定位（表2），結果表明，2種軟件WoLF PSORT和Protcomp預測結果類似，大部分HSFs蛋白家族定位于細胞核。根據軟件WoLF PSORT預測發現，HSFs蛋白家族定位于1～4個位置不等，但除亞洲棉中Cotton_A_24993和除了雷蒙德氏棉中Gorai.006G087100分別定位于葉綠體和細胞質外，其余HSFs蛋白家族定位于細胞核分值最高；根據Protcomp預測發現，除了雷蒙德氏棉中Gorai.004G284200定位于細胞質中，其余HSFs蛋白家族均定位于細胞核。綜上所述，二倍體棉花的HSFs蛋白家族中至少有一種預測定位于細胞核，這符合轉錄因子在細胞核中調控基因表達的作用特點。

2.4 棉花HSFs蛋白家族聚類分析

為了揭示二倍體棉花HSFs蛋白家族的進化關系，將亞洲棉和雷蒙德氏棉的42條和40條HSFs蛋白，與下載的21條擬南芥HSFs蛋白家族進行聚類分析（圖1）。結果顯示，103條HSFs蛋白序列分為了A、B、C 3類，其中A類含有9個亞類（A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9），二倍體棉花都不含有A7亞類，每一亞類中二倍體棉花與擬南芥的蛋白具有較高的同源性，趨向于聚集在一起，例如，雷蒙德氏棉 Gorai.008G170800、Gorai.N013300和亞洲棉Cotton_A_25561、Cotton_A_00864、Cotton_A_24993與擬南芥中的HSF蛋白AT1G67970（AtHsfA8a）互為同源蛋白而聚集在一起。B類含有5個亞類（B1、B2、B3、B4、B5），且二倍體棉花中完整地含有5個亞類，而擬南芥不含有亞類B5。C類中只有1個亞類C1，且二倍體棉花和擬南芥中都存在。此外，不同亞類HSF蛋白雖聚集在一起，但二倍體棉花與擬南芥卻趨向于形成不同的分枝，且亞洲棉中存在與雷蒙德氏棉同源的HSF蛋白（除Cotton_A_24993和Cotton_A_22025）。

2.5 棉花HSFs蛋白家族基序分析

對二倍體棉花82個HSFs蛋白家族保守基序的分析結果見圖2，82個HSFs蛋白家族含有10個保守基序，長度為11～50個氨基酸。進一步分析10個保守基序在不同亞組HSFs蛋白中的分布（圖3）， 結果表明， HSFs蛋白家族含有保守基序個數從2～8個不等，每個亞組具有相同或相似的保守基序類型及排列順序。例如，A1亞類Gorai.003G053300、Gorai.003G183900、Gorai.007G033300、Gorai.004G257000、Gorai.008G225200、Gorai.013G183500、Cotton_A_02851、Cotton_A_05732、Cotton_A_23520、Cotton_A_07921、Cotton_A_33386和Cotton_A_09182具有相似的基序（7～8個），也具有相似的排列順序。

3 討論

在全球氣候變暖的環境下， 高溫對棉花的正常生長發育產生了不利的影響，常常誘使棉葉凋萎，花粉失水干縮，蕾鈴大量脫落[19]。HSFs是植物響應熱激脅迫保護自身免受高溫傷害的一類轉錄因子，研究發現擬南芥、水稻、大豆中分別有21、25、52個HSFs[20-22]。本研究基于二倍體棉花雷蒙德氏棉和亞洲棉測序的完成，通過全基因組進行搜索分析，亞洲棉和雷蒙德氏棉分別鑒定出42個和40個具有典型HSF結構域蛋白，Wang等利用表達序列標簽組裝和全基因組分析技術在陸地棉D亞組中也鑒定得到40個HSFs基因[9]。本研究中HSFs蛋白家族分為A、B、C 3類，每類含有的HSF數目不同，理化性質也存在較大差異，且不均勻地分布在不同染色體上，表明二倍體棉花HSFs蛋白家族存在廣泛的多樣性，這也為功能的多樣性奠定了基礎。

HSFs作為一類轉錄因子，要通過調控相關基因的表達行使功能，其表達模式有組成型表達和誘導型表達2類，廣泛參與植物響應高溫、干旱和氧化等多種逆境脅迫[23-25]。雖然在模式植物擬南芥和番茄中的研究較為詳盡，擬南芥AtHSFA2基因過表達顯著提高了轉基因擬南芥耐熱性[26-27]，而敲除AtHSFA2基因抑制了下游熱激蛋白基因的表達，明顯提高了擬南芥對高溫敏感性[28-29]。棉花中關于HSFs研究的報道還很少，相關研究表明，陸地棉中HSFs基因在響應高溫和纖維發育過程中發揮重要作用[9]。但HSFs表達調控機制尤其是上游調控機制，不同HSFs基因在響應同一外界刺激和同一HSFs基因在不同逆境脅迫中是否存在保守的信號轉導途徑等等，還有待進一步研究闡明。

參考文獻：

[1]Morimoto R I. Regulation of the heat shock transcriptional response：cross talk between a family of heat shock factors，molecular chaperones，and negative regulators[J]. Genes & Development，1998，12（24）：3788-3796.endprint

[2]Baniwal S K，Bharti K，Chan K Y，et al. Heat stress response in plants：a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors[J]. Journal of Biosciences，2004，29（4）：471-487.

[3]Wiederrecht G，Seto D，Parker C S. Isolation of the gene encoding the S. cerevisiae heat shock transcription factor[J]. Cell，1988，54（6）：841-853.

[4]Scharf K D，Rose S，Zott W，et al. Three tomato genes code for heat stress transcription factors with a region of remarkable homology to the DNA-binding domain of the yeast HSF[J]. Embo Journal，1990，9（13）：4495-4501.

[5]Hübel A，Schffl F. Arabidopsis heat shock factor：isolation and characterization of the gene and the recombinant protein[J]. Plant Molecular Biology，1994，26（1）：353-362.

[6]Scharf K D，Berberich T，Ebersberger I，et al. The plant heat stress transcription factor （Hsf） family：structure，function and evolution[J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2012，1819（2）：104-119.

[7]Sakurai H，Enoki Y. Novel aspects of heat shock factors：DNA recognition，chromatin modulation and gene expression[J]. FEBS Journal，2010，277（20）：4140-4149.

[8]Kotak S，Port M，Ganguli A，et al. Characterization of C-terminal domains of Arabidopsis heat stress transcription factors （Hsfs） and identification of a new signature combination of plant class A Hsfs with AHA and NES motifs essential for activator function and intracellular localization[J]. The Plant Journal，2004，39（1）：98-112.

[9]Wang J，Sun N，Deng T，et al. Genome-wide cloning，identification，classification and functional analysis of cotton heat shock transcription factors in cotton （Gossypium hirsutum）[J]. BMC Genomics，2014，15（1）：961.

[10]Harrison C J，Bohm A A，Nelson H C. Crystal structure of the DNA binding domain of the heat shock transcription factor[J]. Science，1994，263（5144）：224-227.

[11]Grlich D，Kutay U. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，1999，15：607-660.

[12]Heerklotz D，Dring P，Bonzelius F，et al. The balance of nuclear import and export determines the intracellular distribution and function of tomato heat stress transcription factor HsfA2[J]. Molecular and Cellular Biology，2001，21（5）：1759-1768.

[13]Li F，Fan G，Wang K，et al. Genome sequence of the cultivated cotton Gossypium arboreum[J]. Nature Genetics，2014，46（6）：567-572.

[14]Wang K，Wang Z，Li F，et al. The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii[J]. Nature Genetics，2012，44（10）：1098-1103.endprint

[15]Finn R D，Coggill P，Eberhardt R Y，et al. The Pfam protein families database：towards a more sustainable future[J]. Nucleic Acids Research，2016，44（D1）：279-285.

[16]Finn R D，Clements J，Eddy S R. HMMER web server：interactive sequence similarity searching[J]. Nucleic Acids Research，2011，39：29-37.

[17]Schultz J，Milpetz F，Bork P，et al. SMART，a simple modular architecture research tool：identification of signaling domains[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（11）：5857-5864.

[18]Jin J，He K，Tang X，et al. An Arabidopsis transcriptional regulatory map reveals distinct functional and evolutionary features of novel transcription factors[J]. Molecular Biology and Evolution，2015，32（7）：1767-1773.

[19]阿布力孜，開賽爾，阿吉古麗，等. 干熱風對棉花生長發育的危害及對策建議[J]. 農業科技通訊，2009（10）：68-69.

[20]Nover L，Bharti K，Dring P，et al. Arabidopsis and the heat stress transcription factor world：how many heat stress transcription factors do we need？[J]. Cell Stress & Chaperones，2001，6（3）：177-189.

[21]Guo J，Wu J，Ji Q，et al. Genome-wide analysis of heat shock transcription factor families in rice and Arabidopsis[J]. Journal of Genetics and Genomics，2008，35（2）：105-118.

[22]Chung E，Kim K M，Lee J H. Genome-wide analysis and molecular characterization of heat shock transcription factor family in Glycine max[J]. Journal of Genetics and Genomics，2013，40（3）：127-135.

[23]Storozhenko S，De Pauw P，Van Montagu M，et al. The heat-shock element is a functional component of the Arabidopsis APX1 gene promoter[J]. Plant Physiology，1998，118（3）：1005-1014.

[24]Panchuk I I，Volkov R A，Schffl F. Heat stress-and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2002，129（2）：838-853.

[25]Panikulangara T J，Eggers-Schumacher G，Wunderlich M，et al. Galactinol synthase 1. A novel heat shock factor target gene responsible for heat-induced synthesis of raffinose family oligosaccharides in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2004，136（2）：3148-3158.

[26]Nishizawa A，Yabuta Y，Yoshida E，et al. Arabidopsis heat shock transcription factor A2 as a key regulator in response to several types of environmental stress[J]. The Plant Journal，2006，48（4）：535-547.

[27]Ogawa D，Yamaguchi K，Nishiuchi T. High-level overexpression of the Arabidopsis HsfA2 gene confers not only increased themotolerance but also salt/osmotic stress tolerance and enhanced callus growth[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（12）：3373-3383.

[28]Schramm F，Ganguli A，Kiehlmann E，et al. The heat stress transcription factor HsfA2 serves as a regulatory amplifier of a subset of genes in the heat stress response in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology，2006，60（5）：759-772.

[29]Charng Y Y，Liu H C，Liu N Y，et al. A heat-inducible transcription factor，HsfA2，is required for extension of acquired thermotolerance in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2007，143（1）：251-262.endprint