2種蛋白質組學方法在石榴中的應用比較

曹尚銀+牛娟+張杰+李好先+薛輝+陳麗娜+劉蓓蓓+張富紅+趙第廣

摘要：對蛋白質組學中的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，簡稱2-DE）、相對和絕對定量同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantification，簡稱iTRAQ）2種技術進行比較，以期為石榴的蛋白質組學研究提供選擇參考。取花后120 d的三白石榴籽粒為材料，分別用雙向電泳、iTRAQ 2種技術檢測三白石榴籽粒蛋白。結果表明，利用2-DE技術檢測到890種蛋白；通過質譜鑒定出5種蛋白；利用iTRAQ技術得到1 940種蛋白，其中分子量在10 ku以下的有16種，200 ku以上的有19種，pH值大于11的有11種，說明iTRAQ技術在鑒定大分子、小分子蛋白方面具有優勢。由以上結果可知，iTRAQ技術比2-DE技術能發現更多數量、更多種類的蛋白，而且iTRAQ技術可以通過信息檢索了解到被檢索肽段的真實身份，該技術的出現，使得對同種蛋白質表達變化的鑒定更為準確。

關鍵詞：雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2-DE）；相對和絕對定量同位素標記（iTRAQ）；蛋白質組學；石榴

中圖分類號： Q946.1；S665.401 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0068-03

基因功能的主要執行者是蛋白質，蛋白質的研究對揭示基因的功能及生命現象的本質有重要意義。然而生命體內的蛋白質極為復雜，一般每個細胞和組織都有數千甚至上萬種蛋白，因而需要一種技術能將大量蛋白同時進行分離。蛋白質組學（Proteomics）是近年來發展的新技術，是從整體水平上認識蛋白質的存在及活動方式（表達、修飾、功能、相互作用等），從而更好地闡明生命科學本質的學科[1]；蛋白質組學可以系統地研究植物體的生理生化變化，動態描述蛋白質水平的表達差異，并鑒定出與其生理生化變化相關的蛋白或基因，以分析植物不同生長時期、不同環境條件對生命過程的影響，從蛋白水平解釋植物各種生理過程的分子機制[2]。因此，蛋白質組學對于果實的發育和組織器官分化、突變體以及對生物和非生物脅迫的適應機制、生理生化過程以及亞細胞結構研究等方面均有著重要的理論與實踐意義。目前，蛋白質組學研究的主要方法有雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，簡稱2-DE）、相對和絕對定量同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，簡稱iTRAQ）技術。2-DE是指利用蛋白質的帶電性和分子量大小的差異，通過2次電泳達到分離蛋白質群的技術[3]。2-DE 利用不同蛋白質分子的等電點和分子量的差異，將不同等電點的蛋白質分子在第1向等電聚焦（IEF）時分離，然后不同分子量的蛋白質分子在第2向聚丙烯酰胺凝膠電泳時被分離，將復雜蛋白質混合物中的蛋白質在二維平面上分開。經過多年發展，目前這種方法可同時分離數千種蛋白，具有分析簡便、快速、分辨率高和重復性好等優點，一直是蛋白質組學研究中應用較多的技術手段。但是，由于受到原理和技術本身的限制，雙向電泳技術自誕生以來，始終存在一些難以解決的缺陷，例如2-DE僅能分離水溶性蛋白，而無法應對非水溶性蛋白或某些極端蛋白；同一樣品獲得的不同重復膠之間經常存在一定的誤差，導致試驗重復性不佳，操作繁瑣，致使試驗周期相對較長等[4]。傳統的雙向電泳技術無法對2個蛋白質樣品的差異進行檢測與定量，因而不能應用于大規模的蛋白質組學分析。

由于蛋白質濃度對于蛋白功能的實現具有重要的作用，一種特殊蛋白質在濃度上的變化，就能預示其細胞的突變過程。因此，對蛋白質的相對、絕對濃度進行測定就變得非常重要[5]。iTRAQ技術是美國應用生物系統公司（Applied Biosystems）（ABI）在2004年推出的一項新的體外同位素標記技術[6]。如今，該技術已經在蛋白質組學的定量研究中得到了極其廣泛的應用，其關鍵是iTRAQ試劑，該試劑由3種不同的化學標簽組成，即報告基團部分（質量為113、114、115、116、117、118、119、121 u）、平衡基團部分（balance group）（質量為192、191、190、189、188、187、186、184 u）和1個相同的反應基團部分（reactive group）。上述8種報告基團通過平衡基團與反應基團相連，可以同時研究8組樣品[7]。因此，該技術同時可以對1個基因組表達的全部蛋白質或1個復雜的混合體系中的所有蛋白質進行精確定量和鑒定。如今，iTRAQ技術已經在果樹蛋白質組學的定量研究中得到了極其廣泛的應用，如Marsh等應用iTRAQ技術研究了白粉菌感染后的葡萄品種Cabernet Sauvignon（敏感型）的蛋白質組變化[8]。但是到目前為止，關于石榴的蛋白質組學研究較少，有關石榴果實發育和代謝相關蛋白質組學研究尚處于起步階段，僅有軟籽和硬籽石榴果皮雙向電泳圖譜對比分析[9]，及軟籽石榴和硬籽石榴籽粒差異蛋白質組學分析[10]。本試驗以三白石榴籽粒為材料，對2-DE、iTRAQ 2種技術在石榴籽粒中的蛋白鑒定效果進行比較研究，以期找出適合石榴組織或器官蛋白質組研究的方法，為石榴蛋白質組學研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以中國農業科學院鄭州果樹研究所石榴優良品種比較圃內7年生白皮的三白石榴（扦插苗定植）為試驗材料，三白石榴為白花、白皮、白籽（硬籽），5月中下旬為盛花期，9月中下旬成熟。從石榴園中選取樹體健壯、大小一致、無病蟲害的9株結果樹，每3株為1組，共3次重復。在大蕾期標記大小基本一致的花蕾，于9月20日取花后120 d的樹冠北面中部內堂果實，迅速切取果實中部籽粒，立刻用液氮保存，然后置于 -80 ℃ 冰箱保存備用。

1.2 試驗方法endprint

1.2.1 雙向電泳 采用三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取石榴籽粒總蛋白。稱取1 g石榴種子加液氮研磨粉碎，在磨好的樣品粉末中加入預冷的10% TCA-丙酮溶液（含0.1%二硫蘇糖醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟），-20 ℃靜置2 h；高速離心20 min，棄上清；將沉淀物放入冷凍真空干燥機中干燥20 min，將干燥的蛋白粉末采用Bradford法進行蛋白質定量[11]。雙向電泳時蛋白質上樣量為110 μg，經固相pH梯度（IPG）（pH值4～7）膠條水合作用過夜后，再進行一維等電聚焦。而后將固化pH值梯度（IPG）膠條用平衡液Ⅰ[0.375 mol/L 三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸，pH值8.8，6 mol/L 尿素，20%甘油，2%十二烷基硫酸鈉（SDS），10 mg/mL 二硫蘇糖醇，痕量溴酚藍]和平衡液Ⅱ[0.375 mol/L 三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸，pH值8.8，6 mol/L 尿素，20%甘油，2% SDS，0.1%二硫蘇糖醇，25 mg/mL 碘乙酰胺，痕量溴酚藍]分別平衡15 min后進行雙向垂直SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結束后，采用考馬斯亮藍染色法檢測[12]，而后用Image Scanner掃描儀（GE Healthcare，USA）對凝膠進行圖像掃描，采用PDQuest 7.2軟件（Bio-Rad，Hercules，USA）進行圖像分析，包括蛋白點檢測、背景扣除、人工校正和凝膠匹配等幾個步驟，對感興趣的蛋白點進行切膠、酶解、肽段濃縮、除鹽、點板。將點板后的樣品放入4 800 TOF/TOF串聯飛行質譜儀（ABI，USA）檢測。第1級質譜得到的肽片段質量指紋圖譜、肽質量指紋圖譜與第2級質譜得到的肽片段序列信息一起通過GPS Explorer 3.6（ABI，USA）和Mascot 2.3.02（Matrix Science Inc，Boston）蛋白質數據庫，找出匹配的蛋白。

1.2.2 iTRAQ 同樣采用TCA-丙酮沉淀法提取石榴籽粒總蛋白，方法同“1.2.1”節。蛋白質定量后取試驗樣品 150 μg，還原，烷基化。胰酶處理，用iTRAQ試劑（ABI，USA）標記樣品，用119、121 u胰酶標記后混合。用Shimadzu LC-20AB HPLC Pump分離，A流動相含25 mmol/L磷酸二氫鈉、25%乙腈溶液，pH值2.7，B流動相含25 mmol/L磷酸二氫鈉、含1 mol/L氯化鉀的25%丙烯腈，pH值2.7。將分離后的肽段進一步用NanoAcquity（Waters，USA）進行反相分離，A有機相含2%乙腈和0.1%甲酸，B有機相含98%乙腈和0.1%甲酸，點板。利用Q-EXACTIVE（Thermo Fisher Scientific，USA）質譜儀對樣品進行檢測。本研究中石榴籽粒蛋白鑒定所使用的數據庫為石榴轉錄組數據庫。得到的肽片段序列信息通過Mascot 2.3.02（Matrix Science Inc，Boston）蛋白質數據庫，找出匹配的蛋白。

2 結果與分析

2.1 三白石榴籽粒的2-DE分析

選用IPG膠條的pH值范圍為4.0～7.0，marker分子量范圍為14.4～116.2 ku，電泳圖中分離的黑點為蛋白質。結果表明，三白石榴籽粒共檢測到890個蛋白點。用PDQuest7.4軟件對籽粒雙向凝膠電泳圖進行分析，發現在14.4～116.2 ku范圍內，分子量主要集中在40～60 ku，大多數為中性蛋白；pH值主要集中在5.0～5.5，多為酸性蛋白。

2.2 基質輔助激光解吸電離/飛行時間（MALDI-TOF/TOF MS）質譜鑒定

根據雙向電泳所得PfkB碳水化合物激酶家族蛋白的肽片段質量指紋圖及其肽序列信息（圖1），通過GPS-MASCOT的離子搜索模式檢索NCBInr真核生物蛋白質數據庫，檢索種屬為綠色植物，數據庫檢索的方式為combined，片段離子質量容差為±0.3 u，最大允許漏切位點為1，酶為胰蛋白酶；質量誤差范圍設置：PMF 100×10-6，串聯質譜誤差（MS/MS tolerance）為0.2 u。檢索出后的蛋白質的分值及其所有肽段離子的總分值都在95%的可信區間內，即錯誤概率在 0.002 5 內，才確定此蛋白鑒定成功。

2.3 液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）鑒定的iTRAQ試驗蛋白質

在數據庫搜索中，MASCOT的離子搜索模式檢索石榴轉錄組數據庫。所有的胰蛋白酶特異性要求容差設定在可接受的范圍內。半胱氨酸的烷基化設為固定修飾，肽段質量誤差為0.02 u，其余參數同“2.2”節。通過iTRAQ分析可知，三白石榴籽粒中共檢測鑒定出1 940種蛋白質，參與了53種代謝通路。在等電點3.0～12.0和分子量7.0～700 ku的范圍內，其中分子量在10 ku以下的有16種蛋白，200 ku以上的有19種蛋白，pH值大于11的有11種蛋白。

2.4 iTRAQ試驗二級質譜結果

在串聯質譜中，報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂，質量平衡基團丟失，帶不同同位素標簽的同一多肽產生質量為114、116、118、120 u的報告離子，根據報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。圖2為果糖激酶表達豐度的iTRAQ二級質譜結果。

3 討論與結論

本試驗分別利用2-DE、iTRAQ技術研究、比較了三白石榴籽粒的蛋白質差異表達變化。通過2-DE研究發現，三白石榴籽粒中共有890種蛋白，而用iTRAQ技術發現了1 940種蛋白，參與了53種代謝通路。可見iTRAQ技術發現總蛋白的種類、數量都比雙向電泳技術要多。由于雙向電泳和iTRAQ技術原理的差異，2-DE技術發現的蛋白大多是胞漿蛋白，而iTRAQ技術發現的不僅有胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白。因為在2-DE技術樣品的制備中，要將組織或細胞中的蛋白釋放出來并處于溶解狀態，而疏水性蛋白和膜性蛋白是難以溶解的，因此容易丟失[13]。由于雙向電泳技術本身的弊端，2-DE技術中首先要進行一維固相pH值梯度等電聚焦，強堿性的蛋白則需要克服反向、陰極向陽極移動以及電滲流等問題，難以分離和檢測強堿性的蛋白。加上受高豐度蛋白的影響，低豐度蛋白的量少。因此，對于低豐度蛋白、極大（相對分子質量>200 ku）和極小蛋白（相對分子質量<10 ku）、極堿性蛋白和疏水性蛋白都難以進行有效分離，限制了其應用范圍。而iTRAQ技術可以對任何類型的蛋白質進行鑒定[14]。在本試驗中，利用iTRAQ技術檢測到分子量在10 ku以下的有16種蛋白，200 ku以上的有19種蛋白，pH值大于11的有11種蛋白，而在雙向電泳中未檢測到這類蛋白。這可能是因為在三羥甲基氨基甲烷/甘氨酸緩沖液中，樣品和游離的十二烷基硫酸鈉離子持續進行積累濃縮，與小分子量蛋白發生對流混合，產生的帶較模糊，從而降低小分子量蛋白的分辨率，其次，可能由于質譜儀對小分子量蛋白較難鑒定。關于高分子量蛋白較少的原因，一方面由于高分子量蛋白滲進IPG膠條比較困難，另一方面是在變性條件下，蛋白質復合物被解聚成多肽或者是大分子，這都是二維電泳技術本身的一些局限性[15-16]，導致它對低豐度蛋白、偏堿蛋白，分子量偏大或偏小的蛋白等難以分離和檢測，而此類蛋白對于基礎與應用研究都極為重要（甚至比高含量結構蛋白更為重要）。此外，有時1個蛋白點含有不止1種蛋白，而在雙向電泳中無法檢測到，如PfkB碳水化合物家族蛋白在雙向電泳中為1個蛋白，而在iTRAQ中檢測到5個PfkB碳水化合物家族蛋白，說明雙向電泳的靈敏度和重復性仍然不理想。而iTRAQ技術中的iTRAQ試劑為同位素，能與賴氨酸及所有肽鏈的氨基末端連接，即在理論上它能標記上所有的氨基酸。國內外多項研究表明，iTRAQ具有較好的定量效果和良好的重復性[1]，因此，用該技術檢測的蛋白數量和種類要比2-DE技術的多。在本研究中，iTRAQ技術得到的蛋白數量是雙向電泳的2倍的結果也證明了這一點，而且在雙向電泳中鑒定到的蛋白在iTRAQ試驗中也都能檢測到。另外，由于2-DE操作費時費力，難以實現和質譜的直接聯用，不易實現自動化。而iTRAQ技術可同時對8種或4種樣本進行定量比較，省時省力。將非凝膠串聯質譜技術與同位素標記技術相結合，能夠實現對多種不同樣本同時進行定量分析的目的。endprint

綜上所述，iTRAQ在鑒定和比較總蛋白的數量、種類上比二維電泳技術有明顯的優勢。而且，iTRAQ技術可以通過信息檢索了解到被檢索肽段的真實身份，iTRAQ技術的出現，使得對同種蛋白質的變化鑒定更為準確。本研究對蛋白質組學中的二維電泳和iTRAQ 2種技術在石榴籽粒中的蛋白鑒定效果進行比較分析發現，iTRAQ技術得到的蛋白數量較多，種類豐富，可能更有利于進一步研究石榴籽粒中復雜的代謝通路，從而為籽粒形成的分子機制研究提供一定的理論參考。

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