甜菜雄性不育系高效組培再生體系的建立

張自強+白晨+張惠忠+李曉東+付增娟+趙尚敏+鄂圓圓+張輝+王良+張必周

摘要：以甜菜雄性不育系32467為材料，對無菌苗植株再生的各個因素進行研究。結果表明，打磨后的種球先熏蒸，再進行消毒處理，可明顯降低污染率；誘導叢生芽再生率最高的外植體是葉柄；最優誘導分化培養基、繼代培養基和生根培養基分別為MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT、MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT和MS+1.2 mg/L NAA。

關鍵詞：甜菜；雄性不育系；再生體系；組織培養

中圖分類號： S566.304.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0107-02

甜菜是我國重要的糖料作物之一，在北方農業生產中占有重要地位。然而隨著甜菜機械化作業程度的不斷提高，特別是大規模集約化生產的不斷推進，甜菜生產中病蟲草害越來越重，通過人工防治病蟲害及除草成本越來越高[1-6]。因此，順應現代農業發展方向、結合甜菜產業發展需求開展甜菜抗性轉基因育種研究可加速育種進程，也是今后甜菜產業發展的必然選擇[7-13]。

部分植物基因工程的遺傳轉化技術相對成熟，但甜菜轉基因育成品種一直未見報道。甜菜轉基因品種未能產業化應用是由多種原因造成的，其中甜菜很難建立起高效的遺傳轉化再生體系是其中一個重要的限制因素[14-15]。本研究通過對甜菜雄性不育系的多種外植體進行再生培養，研究分析影響甜菜外植體再生的因素，建立并優化甜菜植株再生體系，為甜菜轉基因開展前期基礎性工作。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為甜菜雄性不育系32467，由內蒙古農牧業科學院特色作物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗培養 將磨掉花萼完整的甜菜種球，用百菌清（霜霉煙劑）密閉熏蒸24 h后，在超凈工作臺中移至滅過菌的三角瓶中，隨后用75%乙醇消毒2 min，無菌水漂洗3次；再用0.1%的氯化汞處理20 min，無菌水漂洗3次；最后將消毒后的種子接種于MS培養基上，置于組培室培養，培養溫度 23 ℃。

1.2.2 誘導分化培養基的選擇 在超凈工作臺上，將無菌苗置于無菌培養皿中，將無菌苗的葉柄切成1 cm左右的小段，隨后將葉柄接種于含有不同濃度生長調節劑的分化培養基（表1）中進行分化誘導培養，以篩選出誘導葉柄分化成不定芽的最適培養基。每種培養基接種葉柄120個。

1.2.3 高誘導率外植體的篩選 在超凈工作臺中，將無菌苗的下胚軸、葉柄、叢生芽塊均切成長約1 cm的小段，分別置于篩選出的最佳不定芽誘導率培養基，根據不同類型外植體誘導率，確定誘導率最高的培養基。3種不同類型的外植體均接種120個。

1.2.4 繼代培養基的選擇 當誘導的叢生芽長到約1 cm時，在超凈工作臺中將叢生芽分切為單苗，接種于繼代培養基中進行繼代培養（表2），根據不同培養基中幼苗生長情況，篩選最佳繼代培養基。

1.2.5 生根培養基的選擇 將幼苗叢生芽分切成約1.5 cm長的單株，分別接種于含0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/L NAA的MS培養基中，培養室進行培養，培養條件：溫度23 ℃，光照度2 000 lx，光照時間13 h。3周左右即可誘導生根。觀察不同培養基生根情況，根據生根誘導率，確定最佳生根培養基。

2 結果與分析

2.1 誘導分化培養基篩選

由表3可知，不同激素濃度的培養基誘導甜菜叢生芽再生的效果不同。在16種不同激素濃度的培養基中，誘導率最高的是14號培養基，其誘導率達10.3%。因此最佳誘導分化培養基成分確定為MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT。

2.2 不同外植體再生性比較結果分析

將甜菜雄性不育系無菌苗的3種類型外植體，分別接種于篩選出的最佳誘導分化培養基中。由表4可知，葉柄的誘導率最高，達10.8%，明顯高于叢生芽塊的4.2%和下胚軸的6.7%。因此確定最佳的外植體為葉柄。

2.3 繼代培養基篩選結果分析

將生長狀況相似的健壯甜菜雄性不育系叢生芽接種于不同植物激素類型和含量的繼代培養基中，其生長狀況差異較大。由表5可知，添加MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT培養基中叢生芽生長速度最快，植株健壯，無玻璃化、褐化等現象出現，但隨著KT含量的增加，叢生芽出現不生長甚至死亡的現象。接種于含有6-BA激素的培養基中的叢生芽陸續出現玻璃化現象，且隨著6-BA含量的增加，玻璃化現象更加明顯。因而，確定繼代培養基成分為MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT。

2.4 生根培養基篩選結果分析

將生長健壯的叢生芽接種在含有不同濃度NAA的誘導培養基中，由表6可知，當NAA低濃度時生根誘導率隨著NAA濃度的升高而增加，NAA濃度為1.2 mg/L時，誘導率最高，達到83.33%。然而，隨著NAA濃度的持續升高，生根誘導率呈現下降的趨勢。因而確定最佳生根培養基為MS+1.2 mg/L NAA。

3 結論與討論

本研究以甜菜雄性不育系32467為材料，對甜菜無菌苗植株再生的各個因素進行研究，建立了甜菜雄性不育系植株再生體系。乙醇和氯化汞消毒之前，先對打磨后的種球進行熏蒸，可明顯降低污染率；誘導叢生芽再生率最高的外植體是葉柄；篩選出的最優誘導分化培養基MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT；篩選出的最優繼代培養基為MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT；篩選出的最優生根培養基為MS+1.2 mg/L NAA。

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