混合鹽脅迫對水飛薊種子萌發期耐鹽性及水飛薊賓含量的影響

劉廣娜+楊祥波+胡善凱

摘要：以水飛薊為試驗材料，采用濃度為0.1、0.2、0.3 mol/L的混合鹽（NaCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4等物質量混合）溶液分別對水飛薊種子進行處理，計算發芽率、發芽勢和相對鹽害率；選擇大田中長勢相近的水飛薊植株進行不同濃度混合鹽溶液的脅迫處理，測定水飛薊素和水飛薊賓的含量。結果顯示，相對鹽害率隨著處理混合鹽溶液濃度的增大而增加，0.1 mol/L混合鹽溶液處理下，種子相對鹽害率為0；發芽率、發芽勢在0.1 mol/L混合鹽溶液處理下最高，且高于對照組；水飛薊素和水飛薊賓的含量均隨著混合鹽溶液濃度的增高呈現出先增高后降低的趨勢，以 0.2 mol/L 混合鹽溶液的促進作用最好。

關鍵詞：混合鹽；脅迫；水飛薊；耐鹽性；相對鹽害率；水飛薊素；水飛薊賓

中圖分類號： S567.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0144-03

中藥水飛薊為菊科（Asteracea）水飛薊屬植物水飛薊[Silybum marianum （L.） Gaertn]的干燥成熟果實，是一味常用的清熱解毒、疏肝利膽的藥物[1]。其主要成分是水飛薊素，具有抗自由基活性、抗脂質過氧化作用、抗脂氧酶等作用[2]。水飛薊素中以水飛薊賓為主，還含有異水飛薊賓和水飛薊寧[3]。

季平等研究在不同類型鹽堿脅迫下，耐鹽堿大豆品種的各器官生物量、莢數、粒數、產量和生長性狀均顯著高于鹽堿敏感品種[4]。隨著全球工業化的發展，環境污染的加劇，二氧化碳排放量的增加，逐漸形成溫室效應，造成全球氣溫升高，海平面不斷上升，由此引起土壤鹽漬化現象日趨嚴重[5]。當前全世界有 9.55 億hm2鹽堿地，我國約有2 600萬hm2鹽堿地，其中約660萬hm2鹽堿耕地。因此，開發利用鹽堿地，提高鹽堿地的利用率，具有十分重要的意義。本試驗主要研究不同濃度混合鹽溶液對水飛薊種子發芽率、發芽勢、相對鹽害率、水飛薊素和水飛薊賓含量的影響，選出適宜濃度的混合鹽溶液，以期為探究水飛薊栽培新技術提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用水飛薊種子購自安徽亳州明雨中藥材銷售有限公司，種于吉林農業科技學院中藥學院九站藥用植物園。

1.2 萌發期耐鹽性比較

選取大小相同、飽滿的水飛薊種子，用1% NaClO溶液浸泡15 min后，無菌水反復沖洗，用0.1、0.2、0.3 mol/L混合鹽（NaCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4等物質量混合）溶液分別浸泡種子4 h，再將種子均勻地置于鋪有2層濾紙、直徑為10 cm的培養皿中，各加入8 mL相應的混合鹽處理溶液，溫度設定為25 ℃，放在光照培養箱中進行培養，每個處理50粒種子，重復3次，為了保證混合鹽溶液的濃度，每隔2 d換1次處理液及濾紙。每天記錄發芽種子數，以胚根突破種皮記為種子萌發，計算發芽率、發芽勢和相對鹽害率[6]。計算公式如下：

發芽率=（9 d累積發芽的種子數/供檢測的種子總數）×100%；

發芽勢=（4 d累積發芽的種子數/供檢測的種子總數）×100%；

相對鹽害率=（對照發芽率-處理發芽率）/對照發芽率×100%。

當處理發芽率大于對照發芽率時相對鹽害率記為0，視為無鹽害。

1.3 混合鹽脅迫水飛薊植株

選擇大田中長勢相近、生長旺盛、無病蟲害的水飛薊植株進行混合鹽脅迫處理。試驗采用單因素隨機區組設計，設置對照組（CK）和處理組?；旌消}處理組設0.1、0.2、0.3 mol/L等3個濃度水平，每個處理3次重復，每個處理澆灌量為 300 mL，對照組澆灌等量自來水。每10 d澆灌1次，連續澆灌3次。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 水飛薊素含量的測定 稱取2 mg水飛薊賓標準品，用80%乙醇溶液溶解并定容到10 mL容量瓶中，配成水飛薊賓對照品母液，分別吸取水飛薊賓對照品母液0、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，將母液稀釋成不同濃度，用80%乙醇溶液定容至10 mL，于紫外分光光度計上測定288 nm處的吸光度（D288 nm），根據測定的結果，以水飛薊賓對照品母液的濃度為x軸，D288 nm為y軸，得到線性相關方程為y=0.790 7x+0.000 1，r2=0.999 5，并繪制標準曲線。

取2 g水飛薊種子粉于提取燒瓶中，置于超聲波水箱中，每次用12 mL乙酸乙酯溶液在50 ℃下浸提4 h，共計2次，將浸提液合并，經旋轉蒸發回收乙酸乙酯，經過真空干燥得到黃色粉末狀提取物，稱取2 mg水飛薊提取物，然后加入80%乙醇溶液，用超聲波輔助溶解，過濾，定容至10 mL，即為提取物母液，于紫外分光光度計上測定288 nm處的吸光度（D288 nm），最后再根據標準曲線計算出提取物中水飛薊賓的含量[7]。

1.4.2 水飛薊賓含量的測定 色譜條件的選擇：色譜柱為Shimadzu C18（150 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-水-冰醋酸（體積比為48 ∶ 52 ∶ 1），流速1.0 mL/min，進樣量1 mL，檢測波長為288 nm。

標準品溶液的制備：分別精密稱取水飛薊賓A、B標準品各1 mg，各加入1 mL的色譜純甲醇溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即為高效液相法（HPLC）測定用的標準品溶液。

水飛薊賓標準曲線：分別取HPLC測定用水飛薊賓A、B標準品溶液各1、2、3、4、5 μL，按設定好的色譜條件進樣分析。以峰面積為縱坐標，標準品溶液濃度為橫坐標，分別得到水飛薊賓A、B的標準曲線如圖1、圖2所示。

供試品溶液的制備：精密稱取1 g干燥種子粉，用50 mL的石油醚在70 ℃回流3 h。等待提取完成后，將溶液過濾，殘渣用濾紙包裹再用溫風吹干。精密加入150 mL乙酸乙酯溶液，78 ℃水浴回流3 h，過濾，然后用20 mL乙酸乙酯溶液分成2次洗滌燒瓶和濾紙。將濾液和洗滌液合并在一起濃縮至干，再用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，即為高效液相測定用的供試溶液。endprint

2 結果與分析

2.1 不同濃度混合鹽脅迫對水飛薊種子萌發期耐鹽性的影響

2.1.1 不同濃度混合鹽脅迫對種子發芽率的影響 由圖3可知， 在0.1 mol/L混合鹽溶液處理下，水飛薊種子發芽率高于對照組，對種子發芽有促進作用。但隨著混合鹽溶液濃度的增大，發芽率逐漸降低，且低于對照組。

2.1.2 不同濃度混合鹽脅迫對種子發芽勢的影響 由圖4可知，在0.1 mol/L混合鹽溶液處理下，水飛薊種子的發芽勢高于對照組，但隨著混合鹽溶液濃度的增大，發芽勢先降低后上升，但均低于對照組。

2.1.3 不同濃度混合鹽脅迫對種子相對鹽害率的影響 由圖5可知，0.1 mol/L混合鹽溶液對水飛薊種子沒有鹽害，且相對鹽害率隨著混合鹽溶液濃度的增大而升高。

2.2 不同濃度混合鹽脅迫對水飛薊素含量的影響

由圖6可知，水飛薊素的含量隨著混合鹽溶液濃度的升高呈現先上升后下降的趨勢，當混合鹽溶液濃度為0.2 mol/L時水飛薊素的含量最高，比對照組高19%。

2.3 不同濃度混合鹽脅迫對水飛薊中水飛薊賓含量的影響

2.3.1 對照組植株中水飛薊賓含量的測定結果 由圖7可知，對照組植株提取物中含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標準曲線可以計算出水飛薊賓A含量為 2.518 04 μg/mL，水飛薊賓B含量為 3.586 13 μg/mL。

2.3.2 0.1 mol/L混合鹽溶液脅迫下植株中水飛薊賓含量的測定結果 由圖8可知，0.1 mol/L混合鹽溶液處理組含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標準曲線可以計算出水飛薊賓A含量為12.929 61 μg/mL，水飛薊賓B含量為19.239 21 μg/mL，且水飛薊賓A、B的含量均遠高于對照組中的含量，說明0.1 mol/L混合鹽處理對水飛薊賓合成具有較好的促進作用。

2.3.3 0.2 mol/L混合鹽溶液脅迫下植株中水飛薊賓含量測定結果 由圖9可知，0.2 mol/L混合鹽溶液處理組中含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標準曲線可以計算出水飛薊賓A含量為17.245 62 μg/mL，水飛薊賓B含量為25.627 50 μg/mL，且水飛薊賓A、B的含量均高于對照組和0.1 mol/L混合鹽溶液處理組中的含量，說明 0.2 mol/L 混合鹽處理對水飛薊賓合成具有極好的促進作用。

由圖10可知，0.3 mol/L混合鹽溶液處理組含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標準曲線可以計算出水飛薊賓A含量為5.013 48 μg/mL，水飛薊賓B含量為7.472 92 μg/mL，且水飛薊賓A、B的含量均高于對照組中的含量，但低于0.1、0.2 mol/L混合鹽溶液處理組中的含量，說明 0.3 mol/L 混合鹽溶液處理對水飛薊賓合成具有促進作用，但隨著混合鹽濃度的升高，水飛薊賓的含量呈現出先增加后降低的趨勢。

3 討論

在本試驗所采用的3種濃度混合鹽溶液的脅迫下，0.1 mol/L 混合鹽溶液處理下的發芽率、發芽勢均明顯高于對照組，且對種子萌發的相對鹽害率為0；水飛薊素和水飛薊賓的含量均隨著混合鹽溶液處理濃度的升高呈現出先增高后降低的趨勢，以0.2 mol/L混合鹽溶液的促進效果最好。

通過本試驗的研究，可以初步確定適量濃度的鹽堿地可以有助于水飛薊素及水飛薊賓含量的增加。期望本研究的結果可為研究鹽堿脅迫對水飛薊中有效成分含量的影響提供參考。

參考文獻：

[1]張春曉，陳 華，劉友彬，等. 從水飛薊粕及水飛薊殼中提取水飛薊素及水飛薊賓的比較研究[J]. 中成藥，2013，35（10）：2137-2141.

[2]孫鐵民，李 銑. 水飛薊素藥理研究進展[J]. 中草藥，2000，31（3）：229-231，附2.

[3]任冰如，趙友誼，徐柏衡，等. 水飛薊素提取和水飛薊賓純化的研究[J]. 時珍國醫國藥，2012，23（3）：655-656.

[4]季 平，張 鵬，徐克章，等. 不同類型鹽堿脅迫對大豆植株生長性狀和產量的影響[J]. 大豆科學，2013，32（4）：477-481.

[5]李玉明. 混合鹽堿脅迫對高粱的影響[D]. 長春：東北師范大學，2002.

[6]張曉倩，王康才，張彥南，等. 水飛薊萌發期和苗期對鹽脅迫的生長生理響應[J]. 西北植物學報，2013，33（10）：2050-2056.

[7]史勁松，孫達峰，顧龔平，等. 水飛薊素提取工藝的改進和探討[J]. 中國野生植物資源，2006，25（6）：52-54.endprint