“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌的不同組織對鎘的脂質(zhì)過氧化響應(yīng)特征

陳修報+劉洪波+蘇彥平+姜濤+楊健

摘要：為了探究“淡水貝類觀察”研究體系的專用指示生物“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌（Anodonta woodiana）對鎘（Cd）的脂質(zhì)過氧化響應(yīng)的組織特異性，根據(jù)Cd對幼蚌的安全濃度設(shè)定0.005、0.050、0.500 mg/L的濃度梯度，暴露48、96 h 后測定斧足、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜和閉殼肌中丙二醛（MDA）含量。結(jié)果表明，不同組織MDA總體呈現(xiàn)出“誘導(dǎo)—抑制”的變化趨勢；外套膜MDA與Cd表現(xiàn)出顯著的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系（P<0.05）；閉殼肌MDA與暴露時間具有顯著的“時間-效應(yīng)”關(guān)系（P<0.05）。研究認(rèn)為，“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌的外套膜和閉殼肌分別適宜作為基于MDA預(yù)警、監(jiān)測漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd污染程度和污染時間動態(tài)的靶組織。

關(guān)鍵詞：“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌；組織；鎘；丙二醛

中圖分類號： S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0190-03

鎘（Cd）是我國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境中污染面積最廣、危害最大的重金屬之一。《2015年中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報》指出，我國江河天然重要漁業(yè)水域中Cd的超標(biāo)面積為2.1%（約1萬hm2），國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)（內(nèi)陸）Cd的超標(biāo)面積為2.7%（約10萬hm2）[1]。嚴(yán)重影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全，并威脅人類健康[2]。因此，迫切需要對Cd污染進(jìn)行有效診斷。

“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌（人工繁育的生物因子相同、遺傳質(zhì)量穩(wěn)定、污染本底值低）是“淡水貝類觀察”研究體系[3]開展主動監(jiān)測的專用指示生物。移殖“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌已成功監(jiān)測太湖[4]、東湖[5]等典型漁業(yè)水域中Cd等重金屬的污染動態(tài)。然而，軟組織積累重金屬是相對緩慢的過程（可能需要3個月才能達(dá)到動態(tài)平衡[4]），對于Cd響應(yīng)較為靈敏、快速的生物標(biāo)志物的研究在“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌中尚處于亟待開發(fā)的起步階段。

脂質(zhì)過氧化是Cd等有毒物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）增加，氧自由基攻擊細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸（PUFA），致使其發(fā)生損傷的化學(xué)反應(yīng)[6]。丙二醛（MDA）作為脂質(zhì)過氧化的最終代謝產(chǎn)物，能夠靈敏反映Cd對有機體的損傷程度[6]。以MDA為生物標(biāo)志物診斷Cd等重金屬污染狀況已成為研究熱點[6-8]。邢慧芳等發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌成蚌經(jīng)過Cd的急性暴露后，鰓和外套膜MDA含量總體上較對照組顯著增加，但是鰓似乎沒有明顯的“劑量-效應(yīng)”或“時間-效應(yīng)”[7]。Company等研究顯示貝類不同組織的MDA含量變化對Cd具有特異性[6]。

針對上述問題，本研究擬探索適宜用于主動監(jiān)測的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌[4]的4種重要組織（斧足、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌）對Cd的MDA響應(yīng)特征，以期為漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd污染的早期預(yù)警和有效監(jiān)測提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌（6月齡，平均殼長50 mm）來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實驗基地，其人工繁養(yǎng)方法、水環(huán)境條件參照文獻(xiàn)[9]。

氯化鎘（CdCl2）為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。總蛋白和MDA，使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測定。

1.2 毒性實驗

因我國尚沒有物質(zhì)對淡水貝類毒性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究根據(jù)廣泛認(rèn)可的美國“Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussel”（ASTM E2455-06）[10]開展Cd對“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌的暴露研究。

選取規(guī)格一致的幼蚌，用刷子輕輕除去外殼的附著物，于實驗室暫養(yǎng)48 h以適應(yīng)試驗條件。預(yù)試驗顯示Cd對幼蚌 96 h 半效應(yīng)濃度（EC50）為4.500 mg/L，根據(jù)安全濃度（96 h EC50×0.1）以人工配制軟水[10]（pH值為7.3～7.5，硬度為40.000～48.000 mg/L，堿度為30.000～35.000 mg/L）設(shè)定3個Cd濃度梯度0.005、0.050、0.500 mg/L，并設(shè)置3個平行。試驗于貝類重金屬暴露系統(tǒng)（上海海圣水族設(shè)備廠）中進(jìn)行，用10 L一次成型的玻璃缸為試驗容器，試驗液2 L，每個玻璃缸加入5個幼蚌。試驗期間不投餌，每48 h更換75%的試驗液以保持Cd濃度穩(wěn)定，水溫控制在（20±1） ℃，16 h光照、8 h 黑暗，光照度為1 000 lx，溶解氧大于5.000 mg/L。于 48 h 和96 h分別從各濃度組取出3只蚌以待分析。

1.3 脂質(zhì)過氧化測定

解剖分離出幼蚌的斧足、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜和閉殼肌，準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量，按質(zhì)量體積比分別加入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿。勻漿液用冷凍離心機（TGL-16，湘儀離心機儀器有限公司）4 ℃ 2 500 r/min離心10 min獲取上清液，用總蛋白定量測試盒（BCA法）測定總蛋白含量。勻漿液于95 ℃水浴80 min，流水冷卻后4 000 r/min離心10 min獲取上清液，用MDA測試盒（TBA法）分別測定不同組織的MDA含量。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對MDA含量進(jìn)行組間差異性分析，P<0.05表示差異顯著。用Pearson等級相關(guān)系數(shù)分析MDA含量與Cd濃度、暴露時間之間的相關(guān)性，并回歸分析變量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cd對幼蚌MDA影響

由圖1、圖2可見，不同組織MDA對Cd總體呈現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的變化趨勢。在4種組織中，僅外套膜MDA含量與Cd濃度之間具有顯著相關(guān)性（P<0.05）；在 48 h 時呈顯著正相關(guān)（P<0.05），96 h則表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。endprint

2.2 不同暴露時間對幼蚌MDA影響

隨著Cd暴露時間的延長，不同組織MDA含量總體上呈現(xiàn)降低的趨勢（圖1）。內(nèi)臟團(tuán)MDA在 0.500 mg/L 暴露組中與暴露時間呈顯著的線性負(fù)相關(guān)：y=-0.018x+2.204 7（r2=0.728 8）。外套膜MDA在 0.050 mg/L 暴露組中與暴露時間呈顯著的線性負(fù)相關(guān)：y=-0.020 4x+4.296 4（r2=0.753 8）。由圖3可知，閉殼肌MDA在所有暴露組中均表現(xiàn)出顯著的線性負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

低濃度Cd（0.005、0.050 mg/L）對“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌的斧足、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜和閉殼肌的MDA含量總體上在表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，高濃度Cd（0.500 mg/L）對MDA則表現(xiàn)為抑制作用（圖1）。這可能與“毒物興奮效應(yīng)”（Hormesis）[11-12]有關(guān)，即低劑量毒物對有機體代謝表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，而高劑量時表現(xiàn)為抑制作用。同時，生物體不同組織的抗氧化防護(hù)能力具有特異性[6，13]。本研究發(fā)現(xiàn)只有外套膜MDA含量與Cd濃度之間具有“劑量-效應(yīng)”關(guān)系（圖2）。這可能是由于在急性毒性過程中，外套膜作為最先接觸到水環(huán)境的軟體組織[7]，容易受到Cd的損傷。MDA最終下降的響應(yīng)特征與海洋貽貝（Bathymodiolus azoricus）外套膜MDA對重金屬的變化趨勢[6]相類似，卻有別于背角無齒蚌成蚌外套膜對Cd表現(xiàn)為MDA含量升高[7]。這可能是由于暴露成蚌的Cd濃度很高（4.220、8.430、16.820、33.700、 67.45 0 mg/L）[7]，致使其抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，超出了自我恢復(fù)能力。提示“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌外套膜MDA含量變化特征具有應(yīng)用于漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd污染的早期預(yù)警的潛力。

隨著Cd暴露時間的延長，幼蚌能夠發(fā)揮“毒物興奮效應(yīng)”功能，盡快修復(fù)脅迫引起的損傷，并保護(hù)生物體在其后的脅迫中免受或少受傷害[11-12]。因此，不同組織MDA表現(xiàn)為降低的趨勢（圖1）。本研究發(fā)現(xiàn)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌的內(nèi)臟團(tuán)和外套膜僅在0.05、0.50 mg/L的相對較高濃度下，MDA含量和暴露時間表現(xiàn)出“時間-效應(yīng)”關(guān)系。而閉殼肌MDA在整個暴露過程中均具有明顯的“時間-效應(yīng)”關(guān)系（圖3）。這可能是由于內(nèi)臟團(tuán)和外套膜對Cd的解毒功能較強，而閉殼肌主要由橫紋肌和平滑肌2種肌肉纖維組成，解毒能力較弱造成的。貝類對Cd的解毒主要是通過合成金屬硫蛋白（MT）并產(chǎn)生絡(luò)合作用[14]。研究表明，貝類如紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）受到Cd脅迫，內(nèi)臟團(tuán)和外套膜中MT含量及對Cd的吸收量分別是閉殼肌的約3.0倍和1.5倍[15]。提示“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌閉殼肌適宜作為基于MDA指示Cd污染時間動態(tài)的靶組織。

參考文獻(xiàn)：

[1]農(nóng)業(yè)部，環(huán)境保護(hù)部. 2015年中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報[R]. 北京，2015.

[2]姚 茹，黎小正. 廣西沿海主要貝類養(yǎng)殖區(qū)海水、表層沉積物及近江牡蠣體內(nèi)重金屬鎘監(jiān)測與評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：316-318.

[3]Liu H，Yang J，Gan J. Trace element accumulation in bivalve mussels Anodonta woodiana from Taihu Lake，China[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2010，59（4）：593-601.

[4]陳修報，蘇彥平，劉洪波，等. 移殖“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌監(jiān)測五里湖重金屬污染[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，2014，34（1）：225-231.

[5]孫 磊，陳修報，蘇彥平，等. 東湖移殖背角無齒蚌中重金屬的含量變化[J]. 水生生物學(xué)報，2014，38（1）：203-208.

[6]Company R，Serafim A，Cosson R，et al. Temporal variation in the antioxidant defence system and lipid peroxidation in the gills and mantle of hydrothermal vent mussel Bathymodiolus azoricus[J]. Deep-sea Research Part I，2006，53：1101-1116.

[7]邢慧芳，李涌泉，楊慧珍，等. 鎘對背角無齒蚌外套膜和鰓抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2013，33（3）：856-860.

[8]鄭桂紅，王 菲，孫建梅，等. 重金屬銅對紅鯽組織的氧化損傷作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：238-240.

[9]Chen X B，Liu H B，Su Y P，et al. Morphological development and growth of the freshwater mussel Anodonta woodiana from early juvenile to adult[J]. Invertebrate Reproduction & Development，2015，59（3）：131-140.

[10]American Society for Testing，Materials. Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussels[Z]. 2009：E2406-E2455.

[11]顧曉軍，田素芬. 毒物興奮效應(yīng)概念及其生物學(xué)意義[J]. 毒理學(xué)雜志，2007，21（5）：425-428.

[12]Radak Z，Ishihara K，Tekus E，et al. Exercise，oxidants，and antioxidants change the shape of the bell-shaped hormesis curve[J]. Redox Biology，2017，12：285-290.

[13]趙燕靜，蔣昕彧，吳 凡，等. 淇河鯽不同器官組織中抗氧化酶活性和丙二醛含量的比較[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（8）：488-492.

[14]Thorsen W A，Cope W G，Shea D. Toxicokinetics of environmental contaminants in freshwater bivalves[C]// Farris J L，Hassel J H V. Freshwater Bivalve Ecotoxicology. Boca Raton，F(xiàn)lorida：CRC Press，2007：169-213.

[15]Serra R，Isani G，Tramontano G，et al. Seasonal dependence of cadmium accumulation and Cd-binding proteins in Mytilus galloprovincialis exposed to cadmium[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Pharmacology，Toxicology and Endocrinology，1999，123（2）：165-174.endprint