正交設(shè)計(jì)優(yōu)化硬葉兜蘭SSR—PCR反應(yīng)體系

鄭之典　張羅霞　李宗艷

摘要：以構(gòu)建珍稀物種硬葉兜蘭SSR-PCR反應(yīng)體系，采取正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)硬葉兜蘭SSR體系組分中的Mg2+、基因組DNA、DNA Taq聚合酶、dNTPs、引物5個(gè)因素在4個(gè)不同程度上進(jìn)行了組合試驗(yàn)，之后對(duì)反應(yīng)體系中該引物的退火溫度在梯度PCR儀上篩選，并進(jìn)行了最優(yōu)體系的驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果顯示：體積為10μL的PCR管中最優(yōu)組合為：模板 DNA 20 ng，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8 U，10 × buffer（ Mg2+Free） 1 μL，引物PR710的退火溫度為59.6 ℃，說明該體系具有較好的實(shí)用性。

關(guān)鍵詞：硬葉兜蘭；正交設(shè)計(jì)；SSR

中圖分類號(hào)：S682

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2017）21009505

1引言

硬葉兜蘭（Paphiopedilum micranthum）是蘭科中珍稀物種，主要分布于我國(guó)西南部，其觀花時(shí)間長(zhǎng)，花色樸素淡雅，花型獨(dú)特，具有非常高的觀賞價(jià)值[1，2]，在多國(guó)舉行的蘭花展場(chǎng)上曾經(jīng)獲得總冠軍。近年來人們對(duì)硬葉兜蘭野生種過度的挖掘使得個(gè)體和居群數(shù)量快速下降，因此對(duì)其研究和保護(hù)迫在眉睫。

目前硬葉兜蘭的研究主要是關(guān)于繁殖生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)。國(guó)內(nèi)利用無菌播種研究方法說明硬葉兜蘭萌發(fā)率在50%左右，由于兜蘭屬植物種子沒有胚乳，在種子培養(yǎng)時(shí)，適量的有機(jī)添加劑對(duì)其的萌發(fā)能提供較大的幫助[3]；在對(duì)其菌根研究發(fā)現(xiàn)，不同硬葉兜蘭內(nèi)生真菌生長(zhǎng)速率差別很大，利用單菌絲團(tuán)分離法效果顯著，能解決分離過程污染問題[4，5]。

在保護(hù)遺傳學(xué)研究方面，一些學(xué)者對(duì)硬葉兜蘭野生群體研究結(jié)果說明，不同居群有相當(dāng)高的遺傳差異，而且野生群內(nèi)部存在一定的空間結(jié)構(gòu)，所以要考慮不同群體的遺傳狀況才能計(jì)劃硬葉兜蘭的就地保護(hù)[6，7]；有研究通過兩種分子標(biāo)記ISSR和SRAP對(duì)野生居群研究顯示，硬葉兜蘭在物種水平上有較高的遺傳分化[8]；在栽培引種領(lǐng)域，曾宋君等[9]通過對(duì)硬葉兜蘭進(jìn)行溫室栽培，從西南等地引種100株，成活了85株，但是植株形體較差，嫩葉發(fā)育不良，在兩年內(nèi)僅僅6株在培養(yǎng)基質(zhì)里開花；有學(xué)者從硬葉兜蘭在南部地區(qū)應(yīng)用前景分析表明，在該地區(qū)栽培時(shí)不能正常發(fā)育，而且開花率極低，再者其花朵開放時(shí)間短，說明在此地種植是不合適的，當(dāng)?shù)匾N的植株生長(zhǎng)狀況也證實(shí)此問題[10]；就目前硬葉兜蘭生境調(diào)查情況顯示，它主要生長(zhǎng)在石灰?guī)r和灌木叢中，伴生物種豐富，呈聚集性分布[11～13]。

對(duì)野生硬葉兜蘭居群進(jìn)行保護(hù)需要對(duì)居群遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析。然而現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)具有不受環(huán)境、生育階段、不同組織等影響，和其他標(biāo)記相比具有不可替代的作用[14]。SSR（simple sequence repeat）又名微衛(wèi)星，在親緣關(guān)系、遺傳遺傳變異等方面有廣泛的應(yīng)用[15～17]。它具有位點(diǎn)多、多態(tài)性豐富、共顯性、種屬特異性，且重復(fù)性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，被認(rèn)為是目前研究遺傳最好的標(biāo)記之一[18，19]。但是在兜蘭屬應(yīng)用中幾乎沒有，在進(jìn)行SSR分子標(biāo)記時(shí)，反應(yīng)體系中各種因素的濃度大小對(duì)試驗(yàn)效果具有重要作用。所以，一個(gè)最佳效果PCR體系的建立對(duì)SSR擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性非常重要[20]。

鑒于此，本研究已硬葉兜蘭基因組DNA為模板，利用正交表L16（45）對(duì)組合中的5個(gè)成分（基因組DNA、Mg2+、DNA Taq聚合酶、dNTPs、引物）在4個(gè)程度上試驗(yàn)對(duì)照分析，并討論每個(gè)因素濃度的變化對(duì)結(jié)果的影響，最終確定各個(gè)因素的濃度，并對(duì)選擇出的體系進(jìn)行驗(yàn)證。為硬葉兜蘭在在分子領(lǐng)域的研究奠基一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1材料

2.1.1實(shí)驗(yàn)材料

選用云南東南部區(qū)域7野生硬葉兜蘭居群葉片為實(shí)驗(yàn)材料。

2.1.2設(shè)備和儀器

高速冷凍離心機(jī)（LCJ-64-01），PCR擴(kuò)增儀（（美國(guó) Bio-Rad 伯樂公司，Model：PTC—200）；電泳儀；凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)（Kodark）；恒溫水浴鍋。

2.1.3試劑

所用引物來自近緣種同色兜蘭（10對(duì)）和帝王兜蘭（7對(duì)），經(jīng)過首次的篩選，選擇擴(kuò)增出條帶明亮的PR710引物（F：GGAGACACACACACACACACA，R：GGTCTTGGGACACACACACAC）應(yīng)用于此次試驗(yàn)。Mg2+（20 mmol/L）、Taq聚合酶（2 U/μL）、dNTPs（2.5 mmol/L）、Marker（DL2000）、10×PCR Buffer 均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2.2方法

2.2.1試驗(yàn)方法

采用修改優(yōu)化過的的CTAB法[21]對(duì)硬葉兜蘭葉片DNA進(jìn)行提取，并凝膠在電泳儀上測(cè)試DNA提取的效果，在分子實(shí)驗(yàn)室里選擇達(dá)標(biāo)的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將濃度稀釋至 20 ng/μL。

2.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

對(duì)SSR-PCR組合中的5個(gè)因素（基因組DNA、Mg2+、引物、dNTPs、DNATag聚合酶）在4個(gè)不同程度（表1）上變量處理，選用正交設(shè)計(jì)L16（45）正交表（表2），總共16個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共48管，依照表中數(shù)據(jù)加入各個(gè)物質(zhì)再進(jìn)行擴(kuò)增。總體系體積為10 μL，除了表中的5個(gè)因素，每管還有1 μL 10×PCR Buffer，最后加入 dd H2O 補(bǔ)齊到 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共38個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4℃保存。待時(shí)間結(jié)束，DNA片段用2.0%瓊脂糖凝膠在6 V/cm電壓下電泳約20 min，之后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果拍照分析。endprint

2.2.3引物退火溫度的選擇

待16種體系處理完成檢測(cè)后，選定最優(yōu)的體系組合，調(diào)節(jié)引物退火溫度為（59℃±5），在梯度PCR儀上依次生成12個(gè)不同溫度，之后再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.2.4最佳體系的驗(yàn)證

用最佳反應(yīng)體系對(duì)硬葉兜蘭7個(gè)野生居群DNA樣本進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

2.2.5數(shù)據(jù)分析

對(duì)16個(gè)體系的試驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)增出來的條帶按照主帶的明暗，雜帶的數(shù)量等對(duì)每個(gè)結(jié)果打分，目的條帶越明亮、清楚，雜帶越少、得分越高，反之越低，最好可為16分，最差為1分（表3）。用SPSS19.0軟件對(duì)3次評(píng)分結(jié)果做出數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

3結(jié)果與分析

3.1不同處理打分和各個(gè)因素分析

3.1.1電泳結(jié)果評(píng)分

按表2對(duì)16個(gè)處理加樣后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物電泳并用進(jìn)行拍照，如圖1所示。參考何正文等[22]的試驗(yàn)分析理論，對(duì)PCR擴(kuò)增出來的條帶進(jìn)行打分，如表3所示。

3.1.2各個(gè)組分對(duì)PCR結(jié)果影響的分析

用SPSS 19.0對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)方法處理，得到各個(gè)組分?jǐn)?shù)據(jù)，從F值的大小可以看到引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增影響相對(duì)最高，Mg2+的量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果起到較小的作用，各個(gè)試驗(yàn)成分影響大小，由高到低排序：引物>基因組DNA>dNTPs>Taq聚合酶>Mg2+，由表中P值能得到5個(gè)PCR因素不同程度間比較的差異都超過了極顯著刻度值，因此進(jìn)一步對(duì)各因素進(jìn)行因素內(nèi)多重比較。

3.1.3因素內(nèi)各水平對(duì)PCR結(jié)果的影響

（1）引物對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響。由表4可知該物質(zhì)含量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大，引物的濃度能直接影響產(chǎn)物的生成，濃度過低，造成擴(kuò)增的產(chǎn)物減少，過高能使引物與DNA模板之間堿基錯(cuò)配，生成不需要的二聚體[23]，由圖2所示，濃度在0.8 μmol/L時(shí)所得評(píng)分結(jié)果最高，隨著濃度的降低，評(píng)分越低。在對(duì)其不同程度進(jìn)行因素內(nèi)多重比較，發(fā)現(xiàn)其水平除了0.4 μmol/L和0.6 μmol/L兩個(gè)梯度之間對(duì)試驗(yàn)效果影響不顯著，其余各個(gè)水平差異都達(dá)到了顯著水平，所以本實(shí)驗(yàn)顯示引物水平取0.8 μmol/L濃度最合適。

（2）模板DNA對(duì)SSR-PCR的影響。除了引物，基因組DNA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響次之，SSR標(biāo)記對(duì)模板DNA含量要求較低，含量過多不但引起材料的浪費(fèi)，還增加非特異性產(chǎn)物，圖3所示，水平在20 ng/μL評(píng)分結(jié)果最高，并隨著濃度的增加，評(píng)分越來越低。在對(duì)模板在20 ng/μL和40 ng/μL之間差異不明顯其余各個(gè)水平的差異都達(dá)到了極顯著水平，本著節(jié)約試驗(yàn)材料原則所以DNA的含量選20 ng/μL。

（3）dNTPs對(duì)SSR-PCR的影響。dNTPs是堿基互補(bǔ)配對(duì)的4種脫氧核苷酸，也是PCR反應(yīng)的原料，如果濃度過低造成片段數(shù)量的減少，圖4表明濃度在0.3 mmol/L評(píng)分最高，少于或者多余此濃度評(píng)分都呈下降趨勢(shì)。在對(duì)濃度進(jìn)行因素內(nèi)多重分析，發(fā)現(xiàn)第一個(gè)濃度與其余3個(gè)濃度存在差異顯著，其余各個(gè)程度之間差異都不顯著，比較而言，選擇0.3 mmol/L作為dNTPs最佳濃度。

（4）Taq酶對(duì)SSR-PCR的影響。酶能提高擴(kuò)增效率[24]，關(guān)系到PCR試驗(yàn)產(chǎn)物的多少，如圖5所示，在本試驗(yàn)中0.8 U/μL評(píng)分結(jié)果最高，對(duì) Taq酶的4 個(gè)濃度水平行進(jìn)行因素內(nèi)多重比較 ，結(jié)果顯示，0.6 U/μL與0.7 U/μL兩者結(jié)果差異不顯著，其他水平之間都顯著，因此選0.8 U/μL做為本試驗(yàn)Taq酶的濃度。

（5）Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR的影響。本物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最小，它與Taq酶結(jié)合[19]，影響產(chǎn)物合成的速率，過少造成產(chǎn)物的減少，過多引起非特異產(chǎn)物的生成，如圖6所示，當(dāng)水平在3 mmol/L試驗(yàn)打分結(jié)果最高，過高和過低打分都會(huì)下降，對(duì) Mg2+濃度進(jìn)行因素內(nèi)多重比較，發(fā)現(xiàn)水平1與水平3和水平3與水平4之間試驗(yàn)差異達(dá)到極顯著，其余水平之間不顯著。綜合比較選3 mmol/L為 Mg2+最佳濃度。

綜上所述，本研究得到硬葉兜蘭SSR-PCR最優(yōu)體系為：10 μL 反應(yīng)體系中，模板 DNA 20 ng，Mg2+ 3 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8 U/10μL，10×buffer（ Mg2+Free）1 μL。

3.2最佳退火溫度的篩選

退火溫度影響模板DNA與引物的結(jié)合，采用對(duì)引物推薦的退火溫度59 ℃上下浮動(dòng)5 ℃（59 ℃±5），在梯度PCR儀自動(dòng)生成如圖7所示梯度（退火溫度），試驗(yàn)結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)。如圖7所示，溫度過高和過低產(chǎn)物較少，電泳條帶灰暗，因此選擇最亮的條帶（處理7）對(duì)應(yīng)的溫度59.6 ℃作為本引物的最佳退伙溫度。

3.3PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

用優(yōu)化好的體系模板 DNA 20 ng，Mg2+ 3mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8U/10 μL，10× buffer（ Mg2+Free） 1 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μL，對(duì)7個(gè)硬葉兜蘭野生居群DNA樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，每個(gè)居群選取4個(gè)樣本總共28個(gè)。如圖8所示，每個(gè)樣品都能擴(kuò)增出明亮的條帶，說明該體系比較穩(wěn)定，可以為以后硬葉兜蘭遺傳多樣性和親緣關(guān)系相關(guān)的研究提供幫助。

4討論與結(jié)論

PCP擴(kuò)增反應(yīng)中受許多因素和條件的限制[25～28]，研究的5個(gè)因素的含量的多少還有退火溫度的的高低都對(duì)PCR擴(kuò)增效率有重要的意義。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)中的5個(gè)因素在4個(gè)程度上組合優(yōu)化，使之能夠利用有限的試驗(yàn)次數(shù)研究多個(gè)因素不同水平間的相互作用這比單因素試驗(yàn)更加可靠[25]。目前利用正交設(shè)計(jì)方法已經(jīng)在許多物種SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中得到應(yīng)用[16，20]，但是在硬葉兜蘭的研究方面，對(duì)體系的優(yōu)化的報(bào)道較少。endprint

本研究中，引物濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大，濃度過低會(huì)造成擴(kuò)增反應(yīng)無法啟動(dòng)，過高會(huì)造成不必要的引物二聚體的生成，但是在本試驗(yàn)中評(píng)分的結(jié)果根據(jù)引物濃度的變大而增加，在濃度達(dá)到0.8 μmol/L評(píng)分達(dá)到最大，在今后的研究中可以對(duì)引物濃度進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。許多研究表明，模板DNA的含量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，這與本試驗(yàn)有些相似，DNA含量過多時(shí)會(huì)有較多的次生代謝產(chǎn)物，會(huì)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)起到抑制作用。其次四種核糖核苷酸對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有著較大的影響，它是反應(yīng)的基礎(chǔ)，濃度太小會(huì)直接使產(chǎn)物量下降，過高會(huì)和Taq酶爭(zhēng)搶Mg2+與之結(jié)合，造成Taq酶活性下降，從而影響產(chǎn)物的生成。Taq酶的濃度影響擴(kuò)增的效率，但是濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配的幾率，過低造成產(chǎn)物的減少，本實(shí)驗(yàn)選擇最高濃度的水平做為本研究體系中的最佳值，但是對(duì)Taq酶的濃度的選擇可以在以后的研究可以繼續(xù)優(yōu)化。Mg2+ 濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最小，這與許多學(xué)者研究相似，Mg2+可以催化Taq酶的聚合作用，含量的變化都會(huì)Taq酶的活性有著促進(jìn)或者抑制的作用，在另一方面對(duì)試驗(yàn)存在著影響。

本試驗(yàn)研究?jī)?yōu)化硬葉兜蘭基因組DNA SSR-PCR反應(yīng)體系，在10 μL的體積中，模板DNA 20 ng，Mg2+3 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，引物0.8 μmol/L，Taq酶0.8 U/10 μL，10 × buffer（ Mg2+Free） 1 μL，不足用雙蒸水補(bǔ)齊。在對(duì)退火溫度的優(yōu)化上，選擇條帶明亮對(duì)應(yīng)的溫度59.6 ℃做為引物PR710的最佳退火溫度，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行的檢測(cè)，結(jié)果表明該體系能夠在不同的硬葉兜蘭居群中應(yīng)用，并且體系穩(wěn)定，重復(fù)性好，為以后利用SSR標(biāo)記硬葉兜蘭在遺傳變異和親緣關(guān)系等方面打下良好的基礎(chǔ)。

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Abstract：To construct the SSR-PCR reaction system of the rare species P.micranthum，the five factors （Mg2+，template DNA，polymerase，dNTPs and primers）in four levelswere optimized by using the orthogonal design method in P.micranthum SSR reaction system.The annealing temperature of the primer in the reaction system was then screened on a gradient PCR apparatus and the optimal system was verified.The results showed the optimal combination of the PCR reaction system with a total volume of 10μl，20 ngtemplate DNA ，3.0 mmol/LMg2+，0.3 mmol/LdNTPs，0.8 μmol/Lprimer，0.8UTaq DNA polymerase and1μL10 × buffer（Mg2+Free）.The Primers PR710 annealing temperature is 59.6 ℃，which proves that the system has good practicability.

Key words： P.micranthum； orthogonal design； SSRendprint