植物組培污染的原因及防控

吳婷婷

摘要：詳細(xì)分析了植物組織培養(yǎng)污染的種類及其發(fā)生的原因：污染的種類有細(xì)菌和真菌，真菌污染主要來源于環(huán)境，細(xì)菌污染主要來源于接種材料、接種工具、接種無菌操作過程不規(guī)范等。由此提出了做好培養(yǎng)基消毒、環(huán)境清潔衛(wèi)生等日常工作流程、接種過程嚴(yán)格按無菌操作、無菌材料的及時更新等防控措施，以期將污染率控制在合理低范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞：植物組培；污染；防控措施

中圖分類號：S188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：16749944（2017）21011402

1引言

由于植物組培繁殖育苗周期短、可以大批量生產(chǎn)、成本低、可控性強(qiáng)，能為商品林（如桉樹）及花卉工廠化育苗方面做出很大貢獻(xiàn)。但在組培工廠化育苗的日常生產(chǎn)中，污染問題難以回避，而且污染率的增加必然提高生產(chǎn)成本，在市場競爭中，如何降低經(jīng)濟(jì)成本提高經(jīng)濟(jì)效益是工廠化育苗的首要問題，因此防治污染是組培育苗中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)[1]。筆者以林科所的組培廠為實(shí)例，在分析植物組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生污染的原因及其性狀的基礎(chǔ)上，提出了防治措施，為植物工廠化育苗提供技術(shù)參考。

2組培污染的原因及防控措施

植物組培是在無菌條件下進(jìn)行的，若有微生物進(jìn)入培養(yǎng)瓶中，引起污染，組織培養(yǎng)將無法進(jìn)行[2]。污染主要是真菌、細(xì)菌引起的。真菌在培養(yǎng)條件下生長快，很容易觀察到，一般在接種3～5 d后出現(xiàn)，主要癥狀是培養(yǎng)基表面或材料附近出現(xiàn)絨毛狀菌絲，然后形成不同顏色的孢子層，黑色、白色和黃色的孢子層較多見。孢子層從培養(yǎng)基表面長起，逐漸沿著瓶身長到瓶蓋，甚至漫延到瓶外。孢子在空氣中擴(kuò)散，對培養(yǎng)室造成嚴(yán)重污染。所以發(fā)現(xiàn)受到真菌污染的瓶苗，要即時清除出培養(yǎng)室，防止其變成一個污染源，引起其它瓶苗污染。真菌污染主要是由于培養(yǎng)室和接種室的空氣受污染或者室內(nèi)環(huán)境不衛(wèi)生造成，它的重要特點(diǎn)是發(fā)展迅速、難控制。

細(xì)菌潛伏期長，很難在前期肉眼觀察到，一般5～10 d后，會在培養(yǎng)基表面、材料附近或在培養(yǎng)基里面形成（多見白色、黃色）黏液狀菌斑、鼻涕狀或絲狀的菌落，混濁水跡并伴有發(fā)酵狀泡沫。其原因是由于使用了未消毒完全的工具引起，也可能是操作人員呼吸排出的氣體中帶細(xì)菌或培養(yǎng)材料帶細(xì)菌等。

植物組培污染的控制取決于滅菌技術(shù)、滅菌設(shè)備、組培材料的繼代時間、無菌操種過程和環(huán)境條件等許多方面[3，4]。污染有霉菌、黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬、歐文氏菌屬等。真菌污染主要是霉菌來源于環(huán)境，細(xì)菌污染主要來源于接種材料、接種工具、接種無菌操作過程不規(guī)范等，因此污染可通過如下措施克服：接種室與培養(yǎng)室要定期做好消毒與凈化，保持清潔干凈，定期進(jìn)行熏蒸或用70%酒精、新潔爾噴霧消毒。在夏季，在高濕高溫的天氣條件下、或其他有利于真菌繁殖傳播時，建議用甲醛（甲醛用量4～6 mL/m3+高錳酸鉀用量3～6 mL/m3）熏蒸培養(yǎng)室殺菌，甲醛消毒效果好，但甲醛對瓶苗和人體都有一定的傷害，甲醛在滅菌過程中會對瓶苗造成一定的傷害，造成組培苗生長緩慢甚至少部分干枯[5]，所以在瓶苗生產(chǎn)高峰期不用或少用甲醛消毒。在桉樹生產(chǎn)淡季而且是真菌污染較嚴(yán)重時進(jìn)行甲醛消毒。這樣既保證降低污染的同時也不會影響瓶苗的出貨量和質(zhì)量。

在桉樹生產(chǎn)淡季（主要是夏季）降溫消耗電能很多，同時也易污染，所以夏季應(yīng)減少生產(chǎn)量，以保種為主[6]。此時真菌污染比較嚴(yán)重可進(jìn)行甲醛消毒。此外，濕度太高，可以用抽濕機(jī)除濕，應(yīng)使培養(yǎng)室的空氣相對濕度控制在70%左右。組培廠降溫用的空調(diào)也有除濕功能，但在春夏季的多雨天氣中，其除濕效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)未夠，所以使用抽濕機(jī)效果更好，而且從生產(chǎn)成本來說，抽濕機(jī)除濕的費(fèi)用相對空調(diào)低。

秋季和冬季濕度漸漸降低，溫度也漸漸下降，組培苗污染率也相應(yīng)下降。真菌污染大大地減少，培養(yǎng)室內(nèi)空氣含菌量較少，因甲醛對瓶苗和人體都有一定的傷害，所以不用或少用甲醛消毒。平時培養(yǎng)室和接種室一定要保持干凈清潔，下班后和上班前采用紫外燈照射培養(yǎng)室和接種室30 min消毒，臭氧消毒對環(huán)境效果較好，使用方便，對人體傷害小。關(guān)紫外燈后，工作人員不能立即進(jìn)入室內(nèi)，要打開抽風(fēng)機(jī)20～30 min后再工作，防止紫外線輻射對人體造成傷害。常用70%的酒精、新潔爾噴灑培養(yǎng)室和接種室，進(jìn)行室內(nèi)消毒，使空氣中真菌孢子、細(xì)菌沉降，重點(diǎn)噴灑培養(yǎng)架和培養(yǎng)瓶表面，用新潔爾擦洗培養(yǎng)室地面和門窗。

接種用的超凈工作臺（超凈工作臺內(nèi)的潔凈度應(yīng)該為100級）要定期檢查（如定期對風(fēng)機(jī)過濾網(wǎng)清洗衣更換，每隔一段時間檢測操作區(qū)的帶菌量，如發(fā)現(xiàn)過濾網(wǎng)工作失敗，要整個更換。此外，還需要測定操作區(qū)的風(fēng)速，通過調(diào)壓旋鈕使操作區(qū)的網(wǎng)速達(dá)到無菌操作需要的標(biāo)準(zhǔn)），在使用超凈臺前開啟通風(fēng)裝置并打開工作臺紫外燈照射20～30 min，任何進(jìn)入超凈臺的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒，培養(yǎng)瓶的瓶口位置用70%酒精重點(diǎn)擦拭。操作時戴一次性膠手套且接種前用70%酒精噴灑消毒、戴帽子（防止頭發(fā)的灰塵對接種過程中造成污染）、戴口罩（防止呼吸中氣流帶菌對接種過程中造成污染）、穿著接種專用的工作鞋和工作服。接種人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，對接種中所需的工具，如碟子要經(jīng)高溫高壓消毒，鑷子和接種刀在每用一次后都要先用70%酒精擦拭，再放入120 ℃高溫消毒器中消毒（特別在不小心接觸到污染物時，極易由于接種器具引起二次污染），待自然涼冷后再接種，防止接種器械太熱會對接種材料造成熱傷害，影響生長。接種時要在工作臺的操作區(qū)域內(nèi)，工作臺內(nèi)不要擺入過多待用材料，避免工作臺內(nèi)凈化氣流被擋住，嚴(yán)格檢查接種材料，舍棄被真菌和細(xì)菌污染的材料（一般真菌明顯可見，細(xì)菌特別是培養(yǎng)基里面的呈白色濃狀的細(xì)菌不易發(fā)現(xiàn)，在光線充足下要仔細(xì)才能認(rèn)出，易被接種手忽略，經(jīng)接種后造成繼代分再污染，要對接種手辨認(rèn)細(xì)菌進(jìn)行嚴(yán)格訓(xùn)練）。接種中途不要將培養(yǎng)基、接種工具等拿入，破壞超凈臺的無菌環(huán)境。

經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量，如嚴(yán)格按消毒規(guī)程操作后仍有污染現(xiàn)象，特別是在短時間內(nèi)出現(xiàn)大批量的污染苗時（除考慮環(huán)境、氣候外，消毒鍋滅菌質(zhì)量也是一個重要考慮因素），應(yīng)及時檢查滅菌鍋的性能，若發(fā)現(xiàn)問題立即修復(fù)。培養(yǎng)基需要在高壓而且在121～123 ℃條件下滅菌20～30 min，若滅菌時間或滅菌溫度、壓力不夠，培養(yǎng)一段時間后就會在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生污染，所以要嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行。endprint

對于被污染物件的處理：在春、夏季真菌污染嚴(yán)重時，被污染的瓶苗須高溫高壓消毒滅菌再清洗，如果直接清洗，瓶內(nèi)的孢子等污染物擴(kuò)散到空氣中，造成二次污染。對于其他被污染的器械也要單獨(dú)清洗，有條件的要高溫高壓滅菌后再使用。

檢查培養(yǎng)瓶蓋是否存在問題。培養(yǎng)瓶封口多用塑料蓋，塑料蓋用久了易老化，密封性差，空氣中真菌、細(xì)菌會進(jìn)入到瓶內(nèi)造成污染，特別是在真菌污染嚴(yán)重季節(jié)更需要特別注意這個問題。當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶蓋存在問題時，應(yīng)及時更換。

桉樹初代培養(yǎng)或前幾代培養(yǎng)中存在污染，并不形成明顯菌落而只在培養(yǎng)基內(nèi)部形成“絲狀物”、“暈狀物”，肉眼觀測不易發(fā)現(xiàn)，隨著時間過長，材料的健康狀況不斷惡化，造成材料自帶內(nèi)生菌，也是造成污染的一個重要原因。這種情況下可以通過在培養(yǎng)基中添加抗菌素抑制內(nèi)生菌，但很多抗菌素一般不耐高溫，需要采用過濾滅菌。在工廠化育苗生產(chǎn)過程中添加起來不方便。而且針對不同的植物品種要想找到一種合適的抗生素處理組合是較困難的，工作也相對繁瑣，沒有一種抗生素對所有的細(xì)菌都有效，即使有效，抗生素消除植物組培污染的方法也只是暫時的解決方法，如果長期使用抗生素消除污染，必然對組培苗的生長、分化、生根造成一定的影響。因此，還可以通過對材料的更新來避免污染，通過采伐外植體，進(jìn)行外植體誘導(dǎo)分化叢生芽得到新的無菌材料，這樣得到的無菌材料形態(tài)性狀最穩(wěn)定。但耗時長工作量大，應(yīng)在生產(chǎn)淡季就作無菌材料準(zhǔn)備，這樣就可以防止在生產(chǎn)中出現(xiàn)分化材料斷檔情況。

3結(jié)語

植物組培污染種類雖然多種多樣，但只要針對不同的污染情況，做好防控措施，如接種過程嚴(yán)格按無菌操作；培養(yǎng)基和接種器械的消毒在規(guī)定的時間內(nèi)高溫高壓消毒；室內(nèi)環(huán)境清潔衛(wèi)生等日常工作流程嚴(yán)格按規(guī)程做好；在生產(chǎn)淡季可以通過做外植體獲得新的無菌材料，既使分化材料得到更新，又為生產(chǎn)旺季繼代材料作好準(zhǔn)備等，這樣可以將污染控制在合理的低范圍內(nèi)。

參考文獻(xiàn)：

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[6]謝穎苑，容世清，廖飛揚(yáng)，等.提高桉樹組培廠生產(chǎn)效率研究 [J].綠色科技，2016（10）.endprint