正交設計在峨眉金線蓮組織培養中的應用

魯 松,熊鐵一

(1.四川省自然資源科學研究院,四川 成都 610015;2.峨眉山生物資源實驗站,四川 峨眉山 614201)

正交設計在峨眉金線蓮組織培養中的應用

魯 松1,2,熊鐵一1,2

(1.四川省自然資源科學研究院,四川 成都 610015;2.峨眉山生物資源實驗站,四川 峨眉山 614201)

以野生峨眉金線蓮的莖段腋芽為外植體,采用正交設計L16(45)對野生峨眉金線蓮叢生芽誘導、生根的4個因素(基本培養基、6-BA、NAA、AC(活性炭))在4個水平上進行組織培養優化試驗,以期建立完整、高效、廉價的培養體系。結果表明:基本培養基、不同激素濃度配比等因素對峨眉金線蓮的分化、生根有著顯著影響。外植體最佳消毒方案是75%酒精浸泡10s,0.1%的HgCl2浸泡消毒10min;峨眉金線蓮最佳叢生芽誘導培養基為:MS+10%香蕉+6-BA3mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 3g/L;最佳生根壯苗培養基為：1/2MS+10%土豆+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+AC 3g/L。該體系對峨眉金線蓮種質資源保護與開發利用具有一定的參考意義。

峨眉金線蓮;正交設計;組織培養;莖段腋芽;無性繁殖

峨眉金線蓮(Anoectochilus.roxburghiiK.Y.Lang.)隸屬于蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)[1],是以峨眉山命名的峨眉地區特有種,與開唇蘭屬的其他種金線蓮一道統稱金線蓮,別名金線蘭、金絲草。金線蓮在民間有“藥中之王”的美譽,治療范圍廣泛,多用于治療小兒急驚風、高燒不退、腎炎、膀胱炎、高血壓、糖尿病、心臟病、風濕性關節炎、肝脾病、肺癆肺病、咳嗽血虛、血熱吐血、小兒發育不良、毒蛇咬傷等。金線蓮除了具有較高的藥用價值外,由于其金色或白色網狀脈,還是觀賞價值極高的室內觀葉珍品[2]。由于該植物自然生態條件獨特、繁殖率低、生長緩慢,加上蟲類與鳥類嗜食,特別是由于價格昂貴,當地人們過度采挖,使金線蓮野生資源日漸枯竭[3]。

許多研究表明,人工組織培養(簡稱“組培”)繁育的金線蓮組培苗與野生金線蓮同樣具有很高的藥用價值。顧慧芬等比較了金線蓮組培苗與野生金線蓮藥材中多糖、氨基酸和總黃酮的含量[4],結果表明金線蓮組培苗與臺灣野生金線蓮中多糖的含量相近,而廣西種的多糖含量較低,組培苗與野生種的18種氨基酸組成相同含量相近,總氨基酸的含量組培苗遠高于臺灣地區和廣西的野生種,總黃酮含量組培苗與野生植株的含量比較接近。李鳴等比較了野生、人工栽培與組織培養金線蓮的藥理作用[5],發現三種來源的金線蓮在安定、鎮痛劑抗炎效果上無顯著差異,認為其藥理作用基本相近。黃高凌等比較了大棚栽培和野生金線蓮的粗蛋白、粗脂肪、總糖、維生素C、氨基酸、無機元素等成分的含量[6],結果表明,大棚栽培金線蓮的含水量、維生素C、粗蛋白、粗脂肪和氨基酸含量較高,而灰分和總糖分含量則比野生植株低,劉潤東等的結果與上述一致[7]。唐健等比較了野生金線蓮與福建和臺灣組培金線蓮中水分、灰分、無機元素的含量[8],發現不同來源的金線蓮的水分、灰分含量沒有很大差異,但微量元素含量有較大差異。胡國海等的實驗表明[9],野生與人工種植比較,其Fe、Mn、Zn、Co、Cu元素均比人工種植的高，而Cr元素含量人工種植比野生高,有害元素在人工種植和野生中的含量都很低或未檢出。綜上所述,通過組織培養方法進行金線蓮野生資源的開發利用具有重要的實踐意義。

目前金線蓮的開發種類主要為常被稱作福建金線蓮的花葉開唇蘭(A.roxburghii)、臺灣開唇蘭(A.formosanus),臺灣開唇蘭因其葉面具有白色網脈常被稱為“臺灣銀線蓮”。組織培養常見的有福建金線蓮、臺灣金線蓮、滇越金線蓮(A.chapaensis)、白馬山地區金線蓮等[10,11],但對峨眉金線蓮的組織培養報道近乎空白。本文擬以正交法研究幾種因素對峨眉金線蓮組織培養體系構建的影響,擬建立人工快速繁殖(簡稱“快繁”)體系,為保護、開發和利用這一資源提供具有實用價值的資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生峨眉金線蓮(AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.)于2014年7—8月采自四川省峨眉山海拔1000m的林區。

1.2 實驗方法

消毒試驗設計:選取健康粗壯、剪去葉片的野生峨眉金線蓮莖段,在流水下用細毛刷刷洗干凈(特別是根部),再用肥皂水振蕩洗滌后流水沖洗2h,采用兩因素三水平完全隨機試驗設計,設置75%酒精處理(時間10s、20s、30s)、0.1%的HgCl2處理(時間為8min、10min、15min)各3個水平,共9個處理。消毒完成后,剪成1—2cm只留一個腋芽的莖段,平鋪于滅菌后的MS培養基上,每處理20瓶,每瓶10個莖段,每處理3個重復。統計兩周內的污染率,四周后統計成活率。

叢生芽的誘導:試驗選用L16(45)表進行正交實驗設計,選擇基本培養基、6-BA、NAA、活性炭(AC)四因素,濃度各設四水平(表1),共有16個試驗組合。每組合接種10瓶,每瓶10個莖段,60天后統計叢生芽增殖數,計算增殖率。

生根壯苗:將健壯的叢生芽接種于生根壯苗培養基上,選擇基本培養基、6-BA、NAA、活性炭(AC)四因素,濃度各設四水平(表2),共有16個試驗組合,每組合接種10瓶,每瓶10個叢生芽,120天后取出植株洗凈培養基后統計根數、葉片數、株高、單株重。叢生芽誘導、增殖及生根壯苗培養的培養條件都為光照16h/天,光強15—30μmol.m2/s,溫度23±2℃。

表1 不同消毒處理對外植體滅菌效果的影響

表2 叢生芽誘導正交試驗結果

1.3 數據統計分析

本文采用SPSS22.0數據分析系統和Microsoft Excel對試驗觀察數據資料進行方差分析、LSD多重比較等。結果統計中所涉及的測定項目計算公式為:污染率=污染的外植體數/接種的外植體數×100%;成活率=存活的外植體數/接種的外植體數×100%;增殖倍數=叢生芽個數/接種的外植體數;生根數=每處理生根的總數/誘導出根的試管苗數;葉片數=葉片總數/接種的叢生芽數×100%。

2 實驗結果

2.1 不同滅菌處理對外植體滅菌效果的影響

峨眉金線蓮莖段滅菌試驗結果表明(表1),75%酒精滅菌時間10s、20s、30s處理下莖段的污染率和成活率皆有顯著差異，而0.1%的HgCl2滅菌時間(8min、10min、15min)對污染率和成活率的影響也達到顯著水平,0.1%的HgCl210min和15min處理下的污染率差異不明顯。綜合分析表明,處理2和處理3的滅菌效果較好,考慮到成活率峨眉金線蓮莖段的滅菌效果以75%酒精滅菌10s、0.1%的HgCl2滅菌10min最好,外植體污染率為22%,成活率達55.32%。

2.2 不同培養基種類對叢生芽誘導的影響

我們將峨眉金線蓮莖段置入叢生芽誘導、增殖培養基后,約1—2周時間莖段腋芽處開始分化出乳白色的不定芽,4周后可見明顯的叢生芽。從表2可見,不同組合對金線蓮莖芽的誘導有不同效果,其中未添加激素的培養基中芽體可繼續生長,不分化為不定芽,4—5個月后可長成高8cm以上的完整植株。此外,由極差分析可知,6-BA和NAA對叢生芽的增殖影響顯著,其中6-BA影響最大,4種因素作用強弱依次是:6-BAgt;NAAgt;基礎培養基gt;AC。在本實驗設計范圍內得到的峨眉金線蓮叢生芽誘導和增殖的最佳組合為A1B4C2D4,即MS+10%香蕉+6-BA 3mg/L+NAA0.5mg/L+AC 3g/L。我們把滅菌莖段接種于組合A1B4C2D4的培養基后,4周后原球莖的平均增值率達到2.71,比正交實驗中的任何一個組合都高,從而證實了正交篩選的結果。

2.3 不同培養基種類對生根壯苗的影響

我們對經繼代進行增殖,長度大于2cm的叢生芽置入生根壯苗培養基,通過分析不同組合的促根結果可知(表3),不同組合對生根和苗的生長影響很大。

表3 生根壯苗正交試驗結果

就本實驗設計而言,由極差分析可知,NAA對生根及苗的生長影響顯著,4種因素作用強弱依次是:NAAgt;6-BAgt;基礎培養基gt;AC。在本實驗設計范圍內得到的峨眉金線蓮生根壯苗的最佳組合為A4B4C2D4,即1/2MS+10%土豆+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+AC 3g/L。我們將2—3cm高的叢生芽100株,每株10瓶置入A4B4C2D4組合配制的培養基中,經過150天的培養統計,平均生根率3.46、平均葉數5.83、平均株重2.89g、平均株高9.10cm,整體長勢比正交設計中的組合高,證實了正交篩選的結果。

3 討論

以帶腋芽的金線蓮莖段作為外植體進行組織培養實驗時消毒常用70%—75%的酒精與0.1%—0.2%的HgCl2的組合。由于金線蓮含水量較高,高濃度酒精易造成莖段脫水而影響芽體的成活與生長,本實驗的結果也證明了這點。在75%酒精處理20s和30s的組合中,成活率顯著低于短時間的處理。研究證明,在0.1—0.2%的HgCl26—15min處理范圍內莖段芽體的滅菌效果與成活率最好。羅曉青、宋麗莎在貴州金線蓮的實驗中證明,以0.1%的HgCl210min的消毒處理為宜[12,13];劉丹的實驗證明,在福建金線蓮中以0.1%的HgCl2處理10min[14],污染率可低至12.22%,成活率卻能達到82.22%;李艷冬等研究顯示,在福建金線蓮中用0.1%的HgCl2處理8—10min的效果最佳[15];闞世超等以0.15%的HgCl2處理云南金線蓮4min就可達到較好的效果[16]。本實驗中用0.1%的HgCl2處理10min可達到有效效果,污染率低至22%,而成活率可達55.32%。有部分研究表明,添加表面活性劑吐溫-20可降低處理時間,如戴小英等加入吐溫-20后發現滅菌處理5—6min就可有效對外植體進行消毒[17]。由于金線蓮在野外常匍匐生長,因此近腐殖質的部分滅菌難度較大。實驗表明,金線蓮頂部莖段采用0.1%的HgCl2消毒9min可達到最佳效果,而基部匍匐莖段則需要13min。除了常用的金線蓮莖段以外,也有實驗曾采用葉片和種子作為外植體,表明葉片不適合作為外植體[18]。以福建金線蓮和廣東金線蓮種子為外植體的實驗表明,雖然蒴果中種子含量高、易萌發,但長成的植株纖弱,需連續幾次繼代才可達到工廠化母苗的要求,周期時間太長,推廣意義不大[19,20]。

金線蓮增殖一般可分為原球莖和叢生芽兩種方式,以種子為外植體的常先經過原球莖誘導,而以莖段為外植體的則常選擇叢生芽誘導的增殖方式[21]。常用的培養基多為MS或1/2MS等。MS為金線蓮叢生芽提供了較豐富的有效成分。但有實驗認為,MS中大量元素的濃度過高會影響叢生芽的生長與壯苗,而推薦以降低氮源等大量元素濃度的1/2MS或1/4MS為培養基[22],但也有部分文獻認為MS培養基的增殖效果更好[21],本實驗的結果也證實了這點。天然添加物的加入往往會影響叢生芽的生長,本實驗選擇了香蕉汁、馬鈴薯汁與活性炭,實驗結果顯示香蕉汁在對峨眉金線蓮叢生芽誘導上有多種促進作用,效果強于添加馬鈴薯汁,表現在叢生芽較健壯,且能促進葉片發育,這與歐陽凡等在鐵皮石斛上的結果相似[23]。活性炭的加入可吸附瓶苗的代謝廢物以改善生長環境,可促進叢生芽增殖,本實驗得到了證實。叢生芽誘導中常用的生長調節物為6-BA、NAA、ZT、KT、IBA、2,4-D等[12,13],發現上述激素在各自的實驗中都有明顯影響,但常用的仍是6-BA和NAA的組合。有報道顯示,在誘導培養時,6-BA的最佳濃度為0.2mg/L,高于該濃度則有一定下降。但本實驗的結果顯示,峨眉金線蓮的莖段在叢生芽的誘導和增殖時對6-BA有一定的耐受力,在6-BA 3.0mg/L時增殖效果最好,增殖倍率最高,這與周偉香等人的結果一致[24]。陳永快等的實驗結果表明,福建金線蓮在6-BA 4mg/L、臺灣金線蓮在5mg/L時增殖效果最佳[25]。由此可見,不同物種、不同產地對生長調節物的最佳適應劑量差異較大。此外,郭捷華在白馬山金線蓮組培實驗中發現,金線蓮中部和基部莖段的增殖效果好于頂芽,中部莖段誘導的芽體質量好于基部莖段[11]。

在金線蓮產業化生產中,幼苗根系的粗細和發達程度大大影響后續土壤栽培的成活率與產量,而在生產中為了降低成本將生根和壯苗環節常合并在一起。眾多實驗表明,1/2MS培養基有利于生根[26,27],即降低了無機鹽的濃度,而不同的有機添加物在生根和壯苗實驗用也常利用。因此,本實驗除驗證了MS培養基外還驗證了低鹽培養基下的生根狀況,并附加不同濃度的NAA和6-BA誘導根的形成,同時添加了不同的天然添加物。在本實驗中,NAA對峨眉金線蓮的生根和壯苗影響顯著,而MS與1/2MS培養基之間在本實驗中并未顯現出顯著差異,6-BA含量的變化也未對峨眉金線蓮的生根有顯著影響,這與陳永快等實驗結果一致[25]。此外,活性炭在生根和壯苗環節具有吸附植物體分泌的酚類等有害物質,緩慢釋放激素,防止褐化的發生,為根系提供暗環境的作用。但在本試驗中,活性炭含量變化對生根壯苗并未顯現出顯著影響。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第17卷)[M].北京:科學出版社,2000∶223.

[2]范子南,肖華山,范曉紅,等.金線蓮的組織培養研究[J].福建師范大學學報(自然科學版),1997,13(2)∶82-87.

[3]于雪梅,郭順星.金線蓮與內生真菌共生培養體系的建立[J].中國中藥雜志,2000,25(2)∶81.

[4]顧慧芬,莊意麗,梅其春.野生與組培金線蓮有效成分的比較及RAPD分析[J].中成藥,2011,33(8)∶1364-1367.

[5]李鳴,鄒丹.3種不同來源金線蓮的藥理研究[J].海峽藥學,1995,7(4)∶12-14.

[6]黃高凌,蔡慧農,林順長,等.金線蓮的大棚栽培及其重要成分分析[J].集美大學學報(自然科學版),2012,17(2)∶96-100.

[7]劉潤東,郭文杰,林忠寧,等.金線蓮組織培養及營養成分的分析研究[J].廣西農業科學,2006,37(5)∶506-509.

[8]唐健,鄧元榮,卓儀榮.金線蓮的藥理活性研究進展[J].海峽藥學,2008,20(12)∶77-79.

[9]胡國海,李洪潮,解成駿.云南文山人工種植金線蓮中的微量元素含量測定[J].安徽農業科學,2010,38(14)∶7294-7295.

[10]張鐵,田雪琪,李彬.滇越金線蓮快速繁殖技術研究[J].文山師范高等專科學校學報,2006,19(3)∶110-114.

[11]郭捷華.白馬山金線蓮組培快繁關鍵技術研究及其藥用成分比較[D].福州：福建農林大學碩士學位論文,2015.

[12]羅曉青,蒙秋伊,查蘭松,等.興仁金線蓮叢生芽誘導增殖研究[J].安徽農業科學,2012,(22)∶11231-11232.

[13]宋麗莎,鄧偉,文治瑞,等.荔波野生金線蓮芽的誘導及增殖[J].貴州農業科學,2011,39(10)∶43-46.

[14]劉丹.福建戴云山金線蓮工廠化育苗關鍵性技術研究[D].福州：福建農林大學園藝學院碩士學位論文,2013.

[15]李艷冬,葉紅霞,陳麗萍,等.金線蓮組培快繁技術體系的研究[J].江西農業學報,2013,254)∶52-54.

[16]闞世超,張明生,李花.金線蓮叢生芽誘導研究[J].安徽農業科學,2009,37(3)∶981-982.

[17]戴小英,朱恒,宋曉琛,等.金線蓮離體快繁及植株再生[J].江西林業科技,2012,(1)∶25-27.

[18]王雅英,林小華,洪璇.金線蓮外植體篩選及愈傷組織誘導研究[J].亞熱帶植物科學,2011,40(3)∶41-43.

[19]羅安雄,孟志霞,陳曉梅,等.福建金線蓮種子萌發及幼苗培養研究[J].中國醫學,2012,47(15)∶1199-1203.

[20]伍成厚,馮毅敏,賀漫媚,等.金線蓮種子培養的研究[J].中國野生植物資源,2008,27(1)∶47-50.

[21]楊柏云,高蔭榆,李春華,等.金線蓮原球莖的誘導與快速繁殖[J].安徽農業科學,2008,36(10)∶3999-4001.

[22]魏翠華,謝宇,秦建彬,等.金線蓮高產優質栽培技術[J].福建農業科技,2012,(6)∶31-33.

[23]歐陽凡,董文賓,付瑜,等.鐵皮石斛莖段快繁技術的研究[J].生物技術通報,2016,6,32(3)∶63-67.

[24]周偉香,龔寧,李光.花葉開唇蘭種子非共生萌發的研究[J].中草藥,2007,38(4)∶610-613.

[25]陳永快,林一心,鄒暉.福建金線蓮和臺灣金線蓮的組培快繁技術[J].現代園藝,2008,(10)∶9-12.

[26]程云清,劉劍鋒,王占武,等.鞍雜楊組培快繁技術[J].東北林業大學學報,2011,39(2)∶11-12,20.

[27]鄧建軍,李芳東,喬杰,等.白花泡桐優樹試管嫁接幼化及組培快繁技術研究[J].林業科學研究,2011,24(5)∶646-650.

ApplicationofOrthogonalDesigninTissueCultureofAnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.

LU Song1,2，XIONG Tie-yi1,2
(1.Sichuan Academy of Natural Resource Sciences,Chengdu 610015,China; 2.Emei Mountain Biotic Resource Experimental Station,Emei 614201,China)

The genusAnoectochilus(Orchidaceae) was a perennial herb,which comprised more than 40 species that were widespread throughout tropical regions.Several species of this genus were used in Chinese folk medicines,such as A.roxburghii,A.formosanusand A.koshunensis.AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.was an endangered medicinal plant in Emei Mountain,also called “king medicine”,because of its diverse pharmacological effects such as the treatment of hypertension,fever,liver,and lung disease.With the exploitation and the deterioration of the natural conditions,its wild resources were on the brink of exhaustion.In this experiment,the wild plants ofAnoectochilusemeiensisfrom Emei Mountain in Sichuan,were used as the materials for the optimizing studies of industrial-scale micropropagation.Culture in Vitro and propagation were carried out with stems segments and axillary buds ofAnoectochilusemeiensis.The system was optimized by using orthogonal design with 4 levels of 5 factors (Medium,6-BA、NAA、AC(activated carbon)).The result showed that the best explants disinfection solution was to immerse 10s in 75% alcohol plus 0.1%HgCl210min,MS+10% banana+6-BA 3mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 3g/L was the most suitable for bud induction and the optimum for rooting and seedling was 1/2MS+10% potato juice+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+AC 3g/L.This system could provide theoretical help for the protection and utilization ofAnoectochilusemeiensis.

AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.;orthogonal design;tissue culture;stem segment with axillary buds;asexual propagation

10.3969/j.issn.1005-8141.2017.05.017

Q945.52；Q949.71+8.43

A

1005-8141(2017)05-0595-04

2017-03-21；

2017-04-16

國家自然科學基金項目(編號：31470479);四川省基本科研業務費項目資助。

及通訊作者簡介：魯松(1979-),男,山東省泰安人，副研究員,主要從事珍稀瀕危植物保護研究。