miR-451a過表達對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制

張茂娜，張 弘,張 軍,張 雷

(1武漢大學人民醫院鄂州醫院病理科,鄂州 436000;2鄭州大學附屬河南省人民醫院病理科;*通訊作者,E-mail:zmn0306@126.com)

miR-451a過表達對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制

張茂娜1*，張 弘1,張 軍1,張 雷2

(1武漢大學人民醫院鄂州醫院病理科,鄂州 436000;2鄭州大學附屬河南省人民醫院病理科;*通訊作者,E-mail:zmn0306@126.com)

目的 觀察過表達miR-451a對宮頸癌細胞株SiHa和C33A增殖和凋亡的影響,探討其分子機制。 方法 以宮頸癌細胞株SiHa和C33A為研究對象,分為miR-NC組(脂質體轉染miR-NC)和miR-451a組(脂質體轉染miR-451a模擬物),qPCR檢測轉染48 h各組細胞miR-451a、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)和鈣結合蛋白39(CAB39)mRNA的表達,Western blotting檢測各組細胞MIF、CAB39、p-PI3K和p-AKT蛋白的表達,流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡,MTT法和平板克隆實驗檢測細胞增殖能力。 結果 與miR-NC組相比,miR-451a組SiHa和C33A細胞中miR-451a表達均顯著增加(P<0.01),MIF和CAB39 mRNA及蛋白表達顯著減少,CAB39下游蛋白p-PI3K和p-AKT表達下調。miR-451a組細胞周期進展被顯著抑制(P<0.05),細胞凋亡明顯增加(P<0.05),細胞的增殖能力顯著下降(P<0.05)。 結論 過表達miR-451a能夠抑制宮頸癌細胞株的增殖,促進細胞凋亡,其機制可能與下調MIF、CAB39蛋白的表達有關。

微小RNA-451a; 宮頸癌; 細胞增殖; 細胞凋亡

宮頸癌是女性最常見的腫瘤之一,也是女性死亡率最高的腫瘤之一[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌主要的危險因素,與90%以上宮頸癌的發生密切相關,但不可否認的是癌基因和抑癌基因的異常表達對宮頸癌的發生至關重要[2]。近年來宮頸癌的治療方面有了很大的進步,仍有很多宮頸癌患者的預后并不理想。通過miRNA干擾基因表達模式的靶向治療日益成為宮頸癌研究的新方向[3]。miR-451a是一種新發現的在結腸癌、胃癌、食管癌等多種腫瘤中具有抑癌作用的miRNA[4-6]。然而,miR-451a在宮頸癌中的研究未見報道。本研究以宮頸癌細胞株SiHa和C33A為細胞模型,探討miR-451a對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及可能的分子機制,為宮頸癌的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

表1qPCR引物序列

Table1TheqPCRprimersequence

基因 引物序列(5′-3′) U6上游：TCCGATCGTGAAGCGTTC下游：GTGCAGGGTCCGAGGT miR?451a上游：TCCGATTGAGTCATTACCAT下游：GTGCAGGGTCCGAGGT GAPDH上游：CTGGGCTACACTGAGCACC下游：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG MIF上游：CCATGCCTATGTTCATCGTG下游：GAACAGCGGTGCAGGTAAGTG CAB39上游：TGAACCTGCTGCGAGACAAAA下游：TGCGTCTTGTTAGGATTGGCTA

1.2 miR-451a靶基因預測

本研究選擇microRNA.org、miRecords和PicTar 3種預測網站及參考文獻[7,8]預測miR-451a可能的靶基因。miR-451a與MIF mirSVR評分為-1.076 9,PhastCons評分為0.488 9;miR-451a與CAB39 mirSVR評分為-0.577 7,PhastCons評分為0.688 7;miR-451a可能的靶基因為MIF和CAB39,具體的序列互補區域(見圖1)。

圖1 miR-451a與MIF、CAB39基因序列互補區域Figure 1 Complementary regions of miR-451a with gene sequence of MIF and CAB39

1.3 細胞培養與轉染

SiHa和C33A細胞株培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養,取對數生長期細胞,隨機將細胞分為miR-NC組(轉染miR-NC)和miR-451a組(轉染miR-451a)。轉染操作按照LipofectamineTM3000說明書進行,轉染6 h更換新鮮培養基,轉染48 h進行后續實驗。

1.4 qPCR檢測miR-451a、MIF和CAB39 mRNA相對表達量

提取各組細胞總RNA,逆轉錄后進行qPCR檢測。miRNA檢測以U6為內參,mRNA檢測以GAPDH為內參。反應體系和條件參照qPCR試劑盒進行操作,Ct值均以2-ΔΔCt分析比較各組miRNA或mRNA表達差異。

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1.5 Western blotting檢測目的蛋白的表達

細胞轉染48 h后,提取細胞總蛋白,測定蛋白濃度,分別取適量蛋白樣品進行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉至硝酸纖維膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,化學發光法顯影。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

胰酶溶液消化收集細胞，70%乙醇固定4 ℃過夜，棄上清，50 μg/ml RNAse A溶液重懸，室溫下放置1 h，溴化丙啶染液4 ℃下避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。細胞凋亡分析根據Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。

1.7 MTT法檢測細胞增殖

在96孔板上以3×103個/孔接種轉染后的細胞,分別于第1,2,3,4,5天檢測細胞增殖情況。具體操作為：在每個時間點,每孔加入20 μl MTT,繼續培養4 h,棄上清,加入150 μl二甲基亞砜振蕩15 min。酶標儀檢測波長在490 nm處的吸光值。

1.8 平板克隆實驗檢測細胞增殖能力

在6孔板上以1×103個/孔接種轉染后的細胞,于培養箱內培養10 d。取出后采用甲醇固定10 min,結晶紫染液染色30 min,洗去染色,倒置顯微鏡下隨機選取6個視野計數,取平均值進行統計學分析。

1.9 統計學分析

實驗數據均以均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗,所有數據均在SPSS18.0統計軟件中進行統計。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-451a轉染效率測定及各組細胞中MIF和CAB39 mRNA的表達

miR-NC組和miR-451a組SiHa細胞中miR-451a相對表達量分別為1.09±0.52和8 223.46±1 324.91(t=12.410,P<0.001),C33A細胞miR-451a相對表達量分別為1.04±0.33和10 930.67±3 302.61(t=6.619,P=0.001)。與miR-NC組相比,miR-451a組細胞中MIF和CAB39 mRNA的表達顯著下降(見表2)。

細胞分組MIFCAB39SiHa對照組 103±027 101±016實驗組 057±012? 053±024?C33A對照組 109±055 104±035實驗組 032±020? 037±008??

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 過表達miR-451a對靶蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示,與miR-NC組相比,轉染miR-451a后,MIF和CAB39蛋白的表達水平顯著降低,CAB39下游蛋白p-PI3K和p-AKT表達明顯下調(見圖2)。

2.3 過表達miR-451a對細胞周期和細胞凋亡的影響

與miR-NC組相比,miR-451a組細胞在S期和G2/M期的比例明顯下降,G0/G1期細胞的比例顯著增加(P<0.05,見表3),提示細胞被阻滯在G0/G1期。miR-NC組和miR-451a組SiHa細胞凋亡率分別為6.72%±0.87%和26.07%±7.22%(t=5.327,P=0.002),C33A細胞凋亡率分別為8.13%±1.67%和17.77%±2.42%(t=6.560,P=0.001),過表達miR-451a顯著促進宮頸癌細胞的凋亡。

1.miR-NC組；2.miR-451a組圖2 過表達miR-451a對靶蛋白及下游蛋白的影響Figure 2 Effect of miR-451a overexpression on target protein and downstream protein

細胞株組別 G0/G1 SG2/MSiHa對照組4481±3103216±2202304±185實驗組6693±486??2144±156??1163±432??C33A對照組4153±3672814±3423033±228實驗組5882±351??2215±285?1903±241??

與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.4 過表達miR-451a對細胞增殖的影響

MTT檢測結果顯示,與對照組相比,miR-451a組的細胞增殖能力明顯降低(P<0.05,見圖3)。

與miR-NC組相比,*P<0.05圖3 過表達miR-451a對宮頸癌細胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-451a over expression on the proliferation of cervical cancer cells

2.5 過表達miR-451a對細胞克隆形成的影響

miR-NC組和miR-451a組SiHa細胞形成的克隆數分別為206.08±31.25和140.17±30.4(t=3.024,P=0.023),C33A細胞形成的克隆數分別為138.77±17.24和82.75±17.86(t=4.513,P=0.004)。與對照組相比,轉染miR-451a后的宮頸癌細胞形成的克隆數明顯減少(P<0.05)。

3 討論

miRNA是一類長度約為22個核苷酸的小分子非編碼RNA,主要通過與靶基因mRNA的3′UTR區域特異性結合,引起mRNA翻譯抑制或直接導致其降解發揮干擾作用[9]。miRNA的低表達與多種腫瘤的發生發展密切相關,近年來,通過過表達miRNA治療腫瘤的研究逐漸成為熱點[10]。miR-451a是近年來研究較多的miRNA之一,已被證實與多種腫瘤的生物學行為密切相關,miR-451a可通過干擾Ywhaz基因的表達,調節FoxO3蛋白在胞核內的聚集,抑制結腸癌細胞的生長[4];miR-451a可作為胃癌潛在的預后標志物和腫瘤抑制因子[5];miR-451a可通過靶向作用于CDKN2D和MAP3K1,抑制食管癌細胞的增殖[6];miR-451a也可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[11];miR-451a亦可通過靶向干擾Bcl-2基因的表達,影響caspase3蛋白的表達,加速乳腺癌細胞的凋亡,改善乳腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性[12];miR-451a的表達水平與骨肉瘤的預后密切相關,通過靶向干擾CXCL16基因的表達,抑制骨肉瘤細胞的生長和侵襲[13]。miR-451a對宮頸癌生長的作用至今仍未明確。

巨噬細胞移動抑制因子(MIF)最早發現于活化的T淋巴細胞,MIF通過促進腫瘤細胞的增殖、分化、抑制p53依賴性的細胞凋亡,參與腫瘤的發生發展[14]。鈣結合蛋白39(CAB39)參與PI3K/AKT信號通路的活化,最終導致PI3K和AKT的磷酸化,促進細胞周期的進展,抑制細胞凋亡[15]。CAB39在宮頸癌細胞中的研究尚未見文獻報道。本研究顯示,過表達miR-451a后,宮頸癌細胞中MIF和CAB39蛋白的表達水平顯著下降,CAB39下游蛋白p-PI3K和p-AKT表達下調,引起宮頸癌細胞周期G1的阻滯和細胞凋亡的顯著增加,導致宮頸癌細胞的增殖能力顯著下降。以上現象提示miR-451a可能通過靶向干擾MIF和CAB39基因的表達,抑制宮頸癌細胞的增殖,促進細胞凋亡。MIF和CAB39基因與腫瘤細胞遷移和侵襲能力的獲得密切相關[7,16],本研究下一步將重點關注miR-451a干擾MIF和CAB39基因表達后對宮頸癌細胞上皮間充質轉化(EMT)過程的影響,探討其可能的分子機制。同時,本研究也將通過收集臨床宮頸癌組織表達,檢測miR-451a的表達,研究其在診療及預后的生物標志物價值。

綜上所述,過表達miR-451a后,宮頸癌細胞增殖能力顯著下降,細胞凋亡明顯增加,其可能的分子機制為miR-451a干擾MIF和CAB39蛋白的表達,這為臨床治療宮頸癌提供了新靶點。

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EffectofmiR-451aoverexpressiononproliferationandapoptosisofcervicalcancercellsanditsmolecularmechanism

ZHANG Maona1*,ZHANG Hong1,ZHANG Jun1,ZHANG Lei2

(1DepartmentofPathology,EzhouHospital,People’sHospital,WuhanUniversity,Ezhou436000,China;2DepartmentofPathology,People’sHospitalofHenanProvince,ZhengzhouUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:zmn0306@126.com)

ObjectiveTo explore the effect of miR-451a overexpression on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cell lines SiHa and C33A and its possible molecular mechanisms.MethodsThe cervical cancer cell lines were divided into miR-NC group(transfected with miR-NC) and miR-451a group(transfected with miR-451a mimics). The expression of miR-451a, macrophage migration inhibitory factor(MIF) and calcium binding protein 39(CAB39) mRNA was detected by qPCR. The expression of MIF, CAB39, p-PI3K and p-AKT protein was analyzed by Western blotting. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. MTT assay and plate cloning experiment were used to detect the cell proliferation ability.ResultsCompared with miR-NC group, the expression of miR-451a was significantly increased in miR-451a group(P<0.01), while the expression of MIF and CAB39 mRNA was significantly decreased(P<0.05), and the expression of MIF, CAB39, p-PI3K and p-AKT protein were significantly decreased. The cell cycle progression was significantly inhibited in miR-451a group(P<0.05), the apoptosis rate was significantly increased(P<0.05), and the cell proliferation ability was significantly decreased(P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-451a can inhibit the proliferation of cervical cancer cells and promote the apoptosis, which may be related to down-regulation of MIF and CAB39 protein.

microRNA-451a; cervical cancer; cell proliferation; cell apoptosis

張茂娜,女,1987-03生,碩士研究生,E-mail:zmn0306@126.com

2017-07-29

R737.33

A

1007-6611(2017)11-1145-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.012