聲輻射力脈沖彈性成像技術對大鼠肝臟脂肪變性的診斷研究

郭燕榮，董常峰，林浩銘，張新宇，沈圓圓，汪天富，陳思平，劉映霞，陳昕

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聲輻射力脈沖彈性成像技術對大鼠肝臟脂肪變性的診斷研究

郭燕榮1，董常峰2，林浩銘1，張新宇1，沈圓圓1，汪天富1，陳思平1，劉映霞3，陳昕1

(1. 深圳大學生物醫學工程學院，醫學超聲關鍵技術國家地方聯合工程實驗室，廣東省生物醫學信息檢測與超聲成像重點實驗室，廣東深圳 518060；2. 深圳第三人民醫院感染科，廣東深圳 518060；3. 深圳第三人民醫院放射科，廣東深圳 518060)

研究目的是利用聲輻射力脈沖彈性成像技術(Acoustic Radiation Force Impulse，ARFI)評估大鼠肝臟的脂肪變性程度。實驗通過對大鼠喂養不同時間高脂食物從而誘導成肝臟脂肪變性不同階段，進而利用ARFI技術離體測量大鼠肝臟的剪切波速度值(Shear Wave Velocity，SWV)。研究結果顯示，對照組[(2.25±0.52) m/s)]與脂肪變性組[(2.83±0.37) m/s]之間存在著顯著性差異(< 0.05)，而脂肪變性不同階段之間差異卻不明顯。早期炎癥等級與SWV值之間沒有顯著性相關。因此，ARFI彈性成像技術可以有效地區分大鼠肝臟正常組和脂肪變性組，但是對不同脂肪變性程度之間無法做出有效區分。同時，輕微的炎癥活動并不影響ARFI測量。

聲輻射力脈沖彈性成像；脂肪變性；剪切波速度；炎癥

0 引言

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)目前在發達國家人群中的比例達到20%～30%，已成為一種嚴重的公共問題[1]。NAFLD是指病理組織學改變與酒精性脂肪性肝病相似、但無過量飲酒史的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝(Simple Steatosis，SS)和非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH)。其中NASH是NAFLD病程進展的關鍵環節，若NASH得不到有效控制，最終會發展成為更為嚴重的肝纖維化或者肝硬化[2]。因此，臨床上區分NASH和SS有著非常重要的意義。然而，最近的研究成果表明，肝臟的脂肪變性程度與心血管疾病、糖尿病以及肝臟切除手術密切相關[3-5]。因此，在臨床上對肝臟脂肪變性的評估也是一個重要的議題。

肝組織活檢是診斷脂肪變性程度的金標準。然而，組織活檢會產生相應的并發癥，并且有0.01%的幾率導致死亡。此外，這項技術高度依賴于操作者的個人主觀經驗以及受限于組織活檢樣品的尺寸[6]。因此，臨床上急需一種簡單、無創、可靠的脂肪肝診斷方法。

最近20多年，超聲彈性成像技術得到了快速發展，包括準靜態彈性成像(Transient Elastography，TE)和聲輻射力脈沖彈性成像(Acoustic Radiation Force Impulse，ARFI)等。這些技術通過測量組織的彈性值來評估肝纖維化并取得較好的臨床效果[7-8]。這些技術被應用到診斷NAFLD[9-11]。在檢測肥胖型病人的脂肪肝疾病方面，常規的TE技術失敗率達到了25%[5]。為了提升TE技術診斷NAFLD病人的準確率，研究者最近應用一種更低頻率的換能器來檢測身體質量指數較大的病人[9]。而ARFI技術利用聲輻射力聚焦于組織內部使其產生振動，從而測量組織剪切波傳播的速度值(Shear Wave Velocity，SWV)。這種技術可以有效地穿透脂肪層和腹腔，比較適用于肥胖型病人的NAFLD檢測。

脂肪變性是脂肪滴在肝臟細胞中的累積過程，在臨床上幾乎沒有任何癥狀[8]。而由于組織活檢的有創性，病人在臨床上不愿意采用肝組織活檢進行疾病的診斷。因此，臨床中對脂肪變性的研究主要集中在較為嚴重的肝炎和肝纖維化病人中，而對于不含肝纖維化的脂肪變性幾乎沒有相關的報道[12-15]。相關的動物模型也相對較少，如Aroca[16]等人在2010年采用雞的脂肪肝模型來研究SWV值與脂肪變性程度的關系，但是實驗中并沒有考慮肝纖維化因素；2016年的Kang[17]等人采用大鼠NAFLD模型討論彈性值與脂肪變性和肝纖維化的相關性，然而由于模型上的缺陷，研究者并沒有對不含肝纖維化的大鼠進行脂肪變性研究。

本文目的是培養不含肝纖維化大鼠NAFLD模型，采用ARFI彈性成像技術測量大鼠肝臟的SWV值，進而評估其對肝臟脂肪變性的診斷能力。

1 材料和方法

1.1 動物模型

本實驗采用的NAFLD大鼠模型由廣東省醫學動物實驗中心提供。總共69只SD大鼠被隨機分為對照組(12只)和實驗組(57只)，體重為(190±10) g。對照組給予正常飲食；實驗組通過大鼠喂養2周(3只對照組，15只實驗組)、4周(3只對照組，13只實驗組)、6周(3只對照組，14只實驗組)和8周(3只對照組，15只實驗組)高脂食物(食物中包含20%豬油、10%膽固醇、2%膽酸鈉、0.5%丙賽優和30%果糖的高脂乳劑)來誘導成脂肪變性的不同分期。每天觀察動物的外觀體態(毛、色、形)及二便情況并作相應記錄。實驗開始及試驗結束各測量體重1次；實驗期間，每周測量體重各1次。培養結束之后，大鼠被處死，取其右葉的肝臟嵌入到明膠制成的仿體中用于超聲剪切波速度的測量，其它的大鼠肝臟用于組織學評估。

1.2 血液采集

在禁食12 h之后，從大鼠眼眶靜脈竇中取1.5 mL的血液樣本，離心取血清，保存在-80℃條件下。采用如下血清指標：膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(TriGlyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)、丙氨酸轉氨酶(Alanine AminoTransferase，ALT)和天冬氨酸轉氨酶 (Aspartate AminoTransferase，AST)。檢測儀器采用的是全自動生化分析儀(型號7020，日立高新技術公司，東京，日本)。

1.3 組織學評估

離體的大鼠肝臟組織浸泡在 10% 福爾馬林至少24 h后，進行清洗和脫水，常規石蠟包埋切片(厚度7 μm)以及油紅、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin, HE)和馬森(Masson)三色染色處理。最終切片由擁有20年經驗的病理專家采用顯微鏡(BX41，奧林帕斯，美國)進行分析，并且事先對超聲測量結果并不知曉。脂肪變性病理檢測標準為：S0期，含脂滴的肝細胞散在稀少；S1期，含脂滴的肝細胞≤1/4；S2期，1/4＜含脂滴的肝細胞≤1/2；S3期，1/2＜含脂滴的肝細胞≤3/4；S4期，肝組織幾乎被脂滴代替。炎癥的病理檢測標準為：G0，未見炎細胞；G1，匯管區或中央靜脈周圍少量炎細胞散在分布；G2，匯管區、中央靜脈周圍、肝竇內或肝小葉橋接處炎細胞聚集；G3，灶性炎細胞浸潤，伴隨肝細胞變性、壞死；G4，彌漫性炎細胞浸潤，大量肝細胞變性壞死。肝纖維化病理檢測標準為：F0期，無肝纖維化；F1期，匯管區擴大纖維化；F2期，匯管區周圍纖維化或纖維間隔形成，小葉結構保留。F3期，纖維化伴小葉結構紊亂，無肝硬化。F4期，可能的或肯定伴有肝硬化形成。圖1為不同脂肪變性階段的典型組織切片圖。

圖1 脂肪變性不同階段典型組織切片圖

1.4 體外實驗

本研究采用的檢測設備為Acuson S2000彩色超聲診斷儀(西門子，美國)，探頭為8 MHz的線陣換能器，采用Virtual Touch Tissue Quantification 模式進行測量。體外實驗時，右葉肝臟被嵌入在明膠仿體(G2500，西格瑪，美國)的容器中(11 cm×11 cm×7 cm)。感興趣區區域選在明膠仿體表面1.5～2 cm下的肝臟組織中，測量時避開大血管區域。每塊仿體測量10次，取其平均值作為最終大鼠肝臟的彈性值。實驗時超聲醫師對肝臟的病理結果并不知曉。

1.5 動物模型

統計軟件選用SPSS 19。每只大鼠的SWV值用來估計脂肪變性的分期結果。采用帶有Tukey測試的單因素方差分析方法來評估脂肪變性和炎癥不同嚴重等級之間的差異性。ARFI在不同脂肪變性階段之間的診斷能力采用受試者特性曲線面積(Areas Under the Receiver Operating Characteristic，AUROC)，敏感性和特異性采用95%置信區間，截斷值采用最大化約登系數。SWV值與血清指標和炎癥等級之間的相關性采用斯皮爾曼相關系數。以＜0.05為有效差異統計。

2 實驗結果

表1列出了大鼠病理最終結果。圖2是在不同脂肪變性等級的SWV均值和方差統計圖，圖中為處于脂肪變性不同分期的大鼠數量。在S0組平均SWV值為(2.25±0.52) m/s (范圍：1.33～3.26 m/s)；S1組為(2.66±0.40) m/s (范圍：1.53～3.04 m/s)；S2組為(2.90±0.40) m/s (范圍：1.93～3.85 m/s)；S3組為(2.93±0.27) m/s (范圍：2.62～3.52 m/s)；S4組為(2.82±0.28) m/s (范圍：2.36～3.18 m/s)。單因素方差分析結果顯示在正常組和脂肪變性組之間存在著明顯的差異性(< 0.05)。但是在較嚴重的脂肪變性組之間不存在顯著性的差異。圖3是大鼠變性ROC物性曲線，從圖3可見，剪切波速度在預測脂肪變性S1～S3階段的受試者特性曲線面積值為0.82 (95%置信區間= 0.69，0.96；截斷值為2.54 m/s；敏感性= 0.88；特異性= 0.76)。斯皮爾曼相關系數顯示SWV值與脂肪肝嚴重等級之間有中度的顯著性相關(= 0.458，< 0.05)。圖4為大鼠炎癥不同分期的SWV統計圖，由圖4可知，在炎癥G0期的平均SWV值為(2.70±0.42) m/s (范圍：1.53～3.52 m/s)；G1期為(2.63±0.59) m/s (范圍：1.53～3.52 m/s)；G2期為(3.01±0.18) m/s (范圍：2.80～3.16 m/s)。單因素方差結果顯示在炎癥的不同分級之間沒有明顯的差異。表2列出了大鼠的臨床病理結果及對應的血清指標，結果顯示與對照組相比，幾乎所有的血清指標結果都增大。血清指標ALT (= 0.50，< 0.05)，AST (= 0.42，< 0.05)，TC (= 0.47，< 0.05)和LDL (= 0.45，< 0.05) 與SWV值之間顯著性相關，然而TG和HDL指標與SWV值并不相關。在本實驗中，馬森三色染色結果顯示在大鼠肝臟中不存在肝纖維化。

表1 組織學評估結果

圖2 大鼠脂肪變性不同分期的SWV統計圖

圖3 大鼠脂肪變性ROC特性曲線圖

圖4 大鼠炎癥不同分期的SWV統計圖

表2 生化指標統計結果

*生化指標統計結果以均值±標準差表示

3 討論

非酒精性脂肪肝疾病是一個復雜的肝臟疾病,涉及遺傳性、環境因素以及許多未知的生理病理因素等。相比于復雜的人體環境，動物模型可以提供給研究者一種工具來克服這些復雜的因素變量，提高對疾病的生理病理學理解。

非酒精性脂肪肝包括多種組織病理特征，如脂肪變性、炎癥和肝纖維化等。這些因素都有可能影響超聲的發射和剪切波的傳播[7,18]。如Aroca[19]等人在臨床研究結果表明SWV與肝纖維的嚴重等級(F0-F4級)顯著正相關，同時炎癥和脂肪變性因素會對肝臟彈性值產生影響。在本研究中，在大鼠模型中僅存在輕微的炎癥(G1,= 25；G2，= 3；G3，= 0；G4,= 0)，并且沒有肝纖維化。單因素方差分析結果顯示，在炎癥G0期，G1期和G2期之間不存在明顯的差異(> 0.05)。因此，實驗中輕度的炎癥并沒有影響SWV的測量。

在本文中，正常組的平均SWV值為(2.25±0.52) m/s，脂肪變性組為(2.83±0.37) m/s，兩組之間存在明顯的差異(< 0.05)。Aroca[16]等人在雞NAFLD模型在體研究的結果顯示，正常組的SWV值為(0.9±0.1) m/s，脂肪肝組的SWV值為(1.9 ± 0.2) m/s，兩組之間同樣存在明顯的統計學差異(< 0.001)，上述結果與本實驗是相似的。然而，我們的實驗結果與臨床的一些研究結果不同。Nightingale[12]等人在NAFLD病人中，發現脂肪變性程度與SWV值之間沒有明顯的相關性。另外兩個研究結果顯示在NAFLD病人中，SWV值隨著脂肪變性嚴重程度的加深而減小[13,20]。上述研究結論的差異及與本實驗結論的不同可能是由于NAFLD病人帶有多種疾病，如脂肪變性、炎癥和肝纖維化等，這些因素都可以影響SWV值的測量；同時，相對于人體NAFLD模型，動物的模型環境更為簡單。在我們的大鼠模型研究中，脂肪變性是影響ARFI速度測量的主要因素。然而，Kang[17]等人在2016年最新的研究表明，采用超快速剪切波彈性成像測量方法，大鼠正常組和單純性質脂肪肝組之間沒有明顯的差異。上述實驗結果的差異可能是彼此建模方式及測量技術的不同引起的；同時本文研究的大鼠模型只存在脂肪變性和輕微的炎癥，而Kang的動物模型中包含嚴重的肝纖維和炎癥因素。

本研究存在一些不足：理想的大鼠實驗模型中應該只包含脂肪變性這一種因素，但這在現實中是不可能實現的。因為，在大鼠培養期間，脂肪變性和炎癥這兩種病理是同步發展的。在實驗中盡管炎癥存在于大鼠的脂肪肝模型中，但單因素方差分析結果顯示，輕度的炎癥并沒有影響SWV的測量。另一個不足是本研究進行的是體外實驗，雖然這種實驗條件可以克服一些復雜的體內環境因素，如不同個體的體溫邊界條件及不同的脂肪厚度等。但是力學性能和生理特征可能會發生改變。

4 結論

本文的實驗結果顯示，ARFI彈性成像技術可以有效地區分正常組大鼠和脂肪變性組大鼠，但對于不同嚴重等級的脂肪變性卻無法有效檢測。此外，研究發現輕微的炎癥活動并不影響SWV的測量。

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Evaluation of rat liver steatosis by acoustic radiation force impulse elastography

GUO Yan-rong1, DONG Chang-feng2, LIN Hao-ming1, ZHANG Xin-yu1, SHEN Yuan-yuan1, WANG Tian-fu1, CHEN Si-ping1, LIU Ying-xia2, CHEN Xin1

(1. School of Biomedical Engineering, Shenzhen University, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, Shenzhen 518060,Guangdong, China;2. Institute of Infection, The Third People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518060, Guangdong,China;3.Institute of Radiology, The Third People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518060, Guangdong,China)

The goal of this study is to evaluate the utility of acoustic radiation force impulse (ARFI) elastography for determining the severity grade of rat liver steatosis. Steatosis is induced in the rat livers by gavage feeding of a high fat emulsion. Liver mechanics are measured ex vivo using shear wave velocity (SWV) induced by acoustic radiation force. The results show that there is a significant difference between the normal group (2.25±0.52) m/s and steatosis group (2.83±0.37) m/s (<0.05). However, there are no significant differences in SWV measurements between the steatosis grades. SWV values do not correlate with the early grade of inflammation. In conclusion, ARFI elastography is a promising method for differentiating normal rat liver from the rat liver with steatosis, but it cannot reliably predict the grade of steatosis in rat livers. The early grade of inflammation activity does not significantly affect the SWV measurements.

acoustic radiation force impulse elastography; steatosis; shear wave velocity; inflammation.

R312

A

1000-3630(2017)-05-0450-05

10.16300/j.cnki.1000-3630.2017.05.009

2016-12-02;

2017-02-04

國家自然科學基金(81471735、81570552、61427806、61101025、61201041)、國家科技支撐計劃(2015BAI01B02)、廣東省自然科學基金(2016A030310047)資助。

郭燕榮(1988－), 男, 河南南陽人, 博士研究生, 研究方向為醫學信號處理。

陳昕, E-mail: chenxin@szu.edu.cn