淫羊藿次苷Ⅱ改善自發性高血壓大鼠左心室心肌細胞凋亡

吳雨婷，付 舒，岳 云，錢志強，李葉麗，楊丹莉

(基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，遵義醫學院，貴州 遵義 563003)

高血壓是嚴重危害人類健康的心血管疾病之一，目前對它的治療既強調降低血壓，又要注重靶器官的保護[1]。高血壓心臟病是代償負荷所繼發的病理過程，是高血壓患者的主要并發癥之一[2]。因心肌細胞屬于永久細胞，為保證循環血量、增強心肌收縮力，在高血壓初期心肌細胞主要以肥大的形式代償，但同時也會使心肌耗氧、耗能增加；若負荷持續增加，冠狀動脈供血減少，心肌缺血缺氧，導致心肌細胞凋亡增多，病理性重構加重。心肌細胞凋亡是心肌代償性肥厚向心力衰竭過渡的重要機制之一[3]。因此，降低血壓和減少心肌細胞凋亡是改善高血壓心臟病心室重構的重要策略。

淫羊藿是我國傳統中草藥，具有“補腎陽，益氣力，強心力”等藥理功效。黃酮類化合物淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一。現代藥代動力學研究表明，淫羊藿苷在腸道1～2 h內完全轉化為淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ, ICS Ⅱ)[4]。據報道，ICS Ⅱ可以抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡[5]。但關于ICS Ⅱ對心肌細胞凋亡的研究鮮有報道。因此，本研究以自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)為研究對象，觀察ICS Ⅱ是否能夠改善SHR左室心肌細胞凋亡，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器淫羊藿次苷Ⅱ購自南京澤朗醫藥有限公司(純度≥ 98%)；原位細胞凋亡檢測試劑盒( TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)，德國Roche公司；熒光混合物、RNA逆轉錄試劑盒、引物(GAPDH、Bax、Bcl-2)購自TaKaRa生物工程公司；Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3兔抗鼠一抗購自美國Abcam公司； GAPDH小鼠抗大鼠抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG購自江蘇碧云天生物技術研究所。光學顯微鏡及照相系統，日本Olympus公司； RNA逆轉錄儀，德國Eppendorf公司；i-mark酶標儀、real-time RT-PCR擴增儀、Mini PROTEAN3電泳儀、Mini Trans-Blot轉移系統以及CCD成像系統，均為美國Bio-Rad公司產品。

1.2實驗動物及分組13周齡♂ SHR 30只、WKY 6只均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號: SCXK ( 京) 2012-0001。SHR隨機分為模型組、ICS Ⅱ低、中、高劑量組和陽性藥組(n=6)，WKY作為空白對照組(n=6)。ICS Ⅱ低、中、高劑量組分別給予ICS Ⅱ 4 、8、16 mg·kg-1(ig, qd)，至26周齡，陽性藥組給予氯沙坦 20 mg·kg-1，WKY和SHR組給予等體積的雙蒸水。

1.3大鼠血壓測定采用 Kent Scientific CODA 測量大鼠在避光、安靜環境下的鼠尾血壓。

1.4左心質量指數的計算給藥12周后，稱大鼠體重，用7%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，取出心臟，分離左心室，計算左心質量指數=左心室 (g) /體重(g)×100。

1.5左心室病理學觀察將左心室組織置于4%甲醛中固定48 h，脫水、包埋制成蠟塊。切片后行HE染色，在光學顯微鏡下觀察左心室組織的病理學變化。

1.6左心室心肌細胞凋亡檢測上述心臟蠟塊切片、脫蠟，采用終濃度為 20 mg·L-1的蛋白激酶K破膜、3% H2O2消除內源性過氧化物酶后，經TUNEL法染色，具體操作參照試劑盒說明書。最后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察各組心肌細胞凋亡情況，正常細胞和凋亡細胞的細胞核分別被染成藍色和棕黃色。

1.7real-timeRT-PCR法檢測左心室組織Bcl-2、BaxmRNA水平取各組左心室組織，置于TRIzol中提取總RNA，經兩步法-聚合酶鏈反應分別檢測GAPDH、Bcl-2、Bax mRNA的水平。所檢測基因的引物序列參照 GenBank 中大鼠GAPDH、Bcl-2、Bax序列設計(Tab 1)。目的基因表達用相對定量法，以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數(cycle threshold，Ct值) 為統計參數，依次計算下列數據，Ct值的平均值= ( Ctl + Ct2) /2( 重復管)；dCt = Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品 Ct 值的平均值中居中的值)；基因的表達 = 2-dCt；相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達×100，將 WKY 組的mRNA表達設為100。

1.8Westernblot法檢測左心室組織中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白的表達取各組大鼠冰凍左室組織 300 mg，剪碎后放入 1 mL RIPA 裂解液中，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑各 10 μL，冰上勻漿后靜置 30 min， 4℃下 12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，BCA法測定樣本濃度。每孔上樣量為10 μL(含30 μg蛋白)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉至PVDF膜，5%蛋白封閉液封閉 2.5 h，TBST洗膜 10 min×3次，一抗GAPDH (1∶10 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved-caspase-3(1∶2 000) 4℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，二抗(1∶2 000)常溫浸泡1.5 h，ECL 化學發光顯色，CCD 成像系統獲取圖像。

2 結果

2.1大鼠血壓的變化如Tab 2所示，26周齡SHR血壓較WKY明顯升高(P<0.05)，收縮壓是WKY的1.36倍，舒張壓是WKY的1.53倍；與SHR組相比，ICS Ⅱ中、高劑量組和陽性藥組收縮壓分別下降了9.6%、16.6%、20.9%(P<0.05)；舒張壓分別下降了13.6%、27.3%、35.3%(P<0.05)。以上結果表明ICS Ⅱ具有降低SHR血壓的作用。

Tab 1 Primer pairs used in real time RT-PCR

Tab 2 Effect of ICS Ⅱ on SHR blood pressure and left ventricular mass index(n=4)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

Fig 1 Effects of ICS Ⅱ on left ventricular pathology in SHR (×400) A: WKY; B: SHR; C: ICS Ⅱ-L; D: ICS Ⅱ-M; E: ICS Ⅱ-H; F: Losartan

Fig 2 Effects of ICS Ⅱ on apoptosis in left ventricular myocytes (×400) A: WKY; B: SHR; C: ICS Ⅱ-L; D: ICS Ⅱ-M; E: ICS Ⅱ-H; F: Losartan

2.2大鼠左心質量指數的變化與WKY組相比，SHR組左心質量指數升高(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ中、高劑量及陽性藥組左心質量指數明顯下降(P<0.05)，見Tab 2。

2.3大鼠左心室病理學變化HE染色顯示，WKY組心肌細胞大小正常、細胞排列規則；與其相比，SHR組心肌細胞肥大明顯且排列紊亂，可見肌絲斷裂。與SHR組相比，ICS Ⅱ組和陽性藥組細胞肥大減輕且細胞排列趨于整齊，并且以ICS Ⅱ中、高劑量及陽性藥組效果更為明顯，見Fig 1。

2.4左心室心肌細胞凋亡檢測TUNEL染色顯示，與WKY組相比，SHR組心肌細胞凋亡明顯增多；而與SHR組相比，ICS Ⅱ各劑量組和陽性藥組心肌細胞凋亡不同程度減少。表明ICS Ⅱ能減少SHR心肌細胞凋亡，見Fig 2。

2.5大鼠左心組織中Bcl-2、BaxmRNA水平與WKY組相比，SHR組Bax mRNA水平明顯上調(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平明顯下調(P<0.05)；經ICS Ⅱ和氯沙坦處理后，Bcl-2 mRNA水平明顯上調(P<0.05)，Bax mRNA水平下調(P<0.05)，見Fig 3。

2.6大鼠左心組織中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白的表達與WKY組相比，SHR組Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達明顯上調，Bcl-2蛋白表達下調，Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05)；而給予ICS Ⅱ各劑量及氯沙坦治療后，Bax、cleaved-caspase-3水平下調，Bcl-2蛋白表達上調，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 3 Effects of ICS Ⅱ on left ventricular Bcl-2 and Bax mRNA levels(n=6)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

Fig 4 Effect of ICS Ⅱ on expression of Bcl-2, Bax, cleaved- caspase-3 proteins and Bax/Bcl-2 in left ventricle(n=3)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

3 討論

SHR在第6～8周屬于高血壓前期，在12～14周發展為持續性高血壓，隨著疾病進展出現高血壓終末靶器官損傷的許多特征，如心室重構、心力衰竭等[6]。在本研究中，26周SHR已有明顯的動脈性高血壓，收縮壓和舒張壓分別是WKY的1.36倍和1.53倍，而ICS Ⅱ能降低SHR血壓，且以中高劑量效果明顯。病理染色結果顯示，與WKY組相比，SHR組心肌細胞肥大明顯且排列紊亂，可見肌絲斷裂，同時左心質量指數也明顯升高，表明26周齡SHR已出現心室重構，這也與本課題組以往研究的報道一致[7]。而與SHR組比較，ICS Ⅱ中、高劑量和陽性藥氯沙坦心肌細胞排列趨于整齊，心肌細胞肥大不同程度改善，且左心質量指數下降。故ICS Ⅱ具有改善SHR心室重構的作用，其機制可能部分與其降低動脈血壓有關。

心肌細胞僅在胚胎時期進行分裂，當負荷增加時主要是以肥大的形式代償。當負荷持續增加超過這種代償能力時，可導致心肌細胞凋亡。大量研究指出，8周齡以上的SHR均有心肌細胞凋亡，16周齡后其凋亡明顯加速，且細胞凋亡水平與左心室重塑之間具有明顯相關性[6,8-9]。本研究TUNEL染色結果顯示，模型組心肌細胞凋亡數明顯增多，而ICS Ⅱ各劑量及陽性藥組心肌細胞凋亡減少。提示ICS Ⅱ具有抑制心肌細胞凋亡的作用。

大量報道指出，線粒體凋亡途徑在高血壓心臟重塑中起重要作用[10-11]。一直以來，Bcl-2家族都受到了廣泛關注，它包括促凋亡家族和抗凋亡家族。促凋亡Bcl-2家族包括含有BH3-only結構域的蛋白(如Bim、Bid、Bad)和多結構域蛋白(如Bax、Bak)。在受到凋亡信號刺激時， BH3-only蛋白被激活，直接或間接促進Bax/Bak寡聚，使線粒體外膜通透性改變和細胞色素C釋放，釋放入細胞質的細胞色素C又可導致caspase-3裂解活化，執行細胞凋亡；抗凋亡Bcl-2家族主要通過與促凋亡家族成員形成異源二聚體，維持線粒體膜的通透性以抑制細胞色素C的釋放，從而減輕細胞凋亡[12-14]。抗凋亡和促凋亡家族蛋白失衡是細胞凋亡的關鍵因素。在本項研究中，與WKY相比，SHR左心組織中促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白的表達上調，執行凋亡的cleaved-caspase-3蛋白上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白的表達明顯下調，Bax/Bcl-2比值升高，以上結果表明線粒體凋亡途徑是SHR心肌細胞凋亡的途徑之一。而經ICS Ⅱ處理后，抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯上調，而Bax mRNA水平和Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達均下調，Bax/Bcl-2比值降低，提示ICS Ⅱ可以通過抑制線粒體凋亡途徑減輕SHR心肌細胞凋亡。

綜上，ICS Ⅱ可減輕SHR左心室心肌細胞凋亡，其機制與其降低血壓和抑制線粒體凋亡途徑相關。

(致謝：本實驗在遵義醫學院基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室完成，感謝藥理學教研室的支持和幫助，感謝朱玲、孫瑞敏、吳芹、黃波提供的幫助!)

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