澤瀉湯對(duì)高脂血癥大鼠脂代謝及PPARα和ACO基因和蛋白表達(dá)的影響

韓 雪，張睦清，常 冰，王 茜，郝 蕾，劉 宇，石 鋮，郭秋紅，張一昕

(1. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床中藥學(xué)教研室，河北 石家莊 050200；2. 河北省中醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050017；3.石家莊市中醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050017)

高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)主要是指血漿中膽固醇(total cholesterol，TC)和(或)甘油三酯(triglyceride，TG)水平升高，其本質(zhì)是人體內(nèi)脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的紊亂，屬于代謝性疾病，是導(dǎo)致脂肪肝、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的重要因素之一[1-2]。近年來(lái)，人們攝入脂肪增多，但體力運(yùn)動(dòng)減少，使高脂血癥的發(fā)病率日益攀高。中醫(yī)藥在防治高脂血癥方面較西藥有明顯優(yōu)勢(shì)，研究發(fā)現(xiàn)[3]，澤瀉、白術(shù)作為藥對(duì)單獨(dú)使用或與他藥配伍使用治療高脂血癥的情況尤其多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)主要從肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor-α，PPARα)途徑入手，觀察澤瀉湯(Rhizoma Alismatis decoction，RAD)對(duì)肝臟PPARα和其下游基因乙酰輔酶A氧化酶(acyl CoA oxidase，ACO)基因和蛋白表達(dá)的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料

1.1動(dòng)物健康♂ SD大鼠50只，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為1209029。

1.2藥物澤瀉、白術(shù)兩味中藥，購(gòu)于石家莊市樂(lè)仁堂藥店，水煎濃縮至所需濃度。血脂康膠囊(批號(hào)：20120701)，以蒸餾水配制所需濃度。

1.3試劑TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol ，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；DEPC(Sigma公司)；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker(TaKaRa公司)；兔抗PPARα抗體(美國(guó)Bioworld公司)、兔抗ACO抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.4儀器VANOX AHB-LB型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RM2345石蠟切片機(jī)(LEICA公司)；PE9600型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(法國(guó)VL公司BIO-PROFIF)等。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及造模將50只大鼠隨機(jī)分為5組，即：空白對(duì)照組(Control)、模型對(duì)照組(Model)、澤瀉湯高劑量組(H-RAD)、澤瀉湯低劑量組(L-RAD)、血脂康對(duì)照組(XZK)，每組10只。空白組喂飼普通飼料，其余以高脂飼料(參照文獻(xiàn)[4]1.5%膽固醇、0.5%豬膽酸鈉、88%普通飼料、10%豬油)喂飼造模，共4周。

2.2給藥方法及標(biāo)本采集自造模d 1開(kāi)始，澤瀉湯各劑量組和血脂康組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，用藥劑量為21.0、10.5、0.2 g·kg-1，空白組和模型組灌服等量蒸餾水，每日1次，用藥體積為10 mL·kg-1。4周末，10%水合氯醛麻醉，股動(dòng)脈取血，分離血清。同時(shí)迅速剖取肝臟，取部分肝組織，液氮凍存，另取大小適宜的肝組織固定于4%多聚甲醛液中。

2.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1血清脂質(zhì)含量的檢測(cè) 酶法測(cè)定血清TC、TG、HDL、LDL的含量。

2.3.2肝組織形態(tài)學(xué)的觀察 取在4%多聚甲醛中固定的肝組織，HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)的改變。

2.3.3肝組織PPARα mRNA、ACO mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定肝臟PPARα mRNA和ACO mRNA的表達(dá)。細(xì)胞總RNA提取采用TRIzol一步法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算相對(duì)含量。

2.3.4肝組織PPARα、ACO蛋白表達(dá)的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取肝組織細(xì)胞核蛋白，常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)至PVDF膜，小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉2 h。加入一抗孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗孵育90 min，PBST洗滌3次，每次10 min，應(yīng)用ECL 發(fā)光試劑盒反應(yīng)，經(jīng)X線片曝光，顯影液、定影液顯色后，根據(jù)條帶的亮度以及背景情況可以再次選擇曝光時(shí)間進(jìn)行二次曝光。用Tanon Gis軟件分析X線片上的條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠血清脂質(zhì)水平模型組大鼠血清TC、TG和LDL的含量均高于空白組(P<0.01)，HDL含量低于空白組(P<0.01)；用藥后，澤瀉湯各劑量組及血脂康組大鼠血清TC、TG、LDL含量均明顯降低(P<0.01)，HDL含量均明顯升高(P<0.01)。其中，低劑量組TC和TG含量均高于血脂康組和高劑量組(P<0.01);低劑量組的LDL含量高于血脂康組和高劑量組(P<0.01)。見(jiàn)Tab 1。

3.2各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化如Fig 1所示，空白組大鼠肝小葉清晰可見(jiàn)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列成肝索。模型組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性，可見(jiàn)大泡型脂肪滴，細(xì)胞核偏離中心。澤瀉湯各劑量組與血脂康組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度均有所減輕。

Tab 1 Content of TC, TG, HDL and LDL in serum of HLP rats(±s，n=10)

##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsXZK

3.3各組大鼠肝組織PPARα和ACOmRNA的表達(dá)如Fig 2所示，模型組大鼠PPARα和ACO mRNA的表達(dá)均弱于空白組(P<0.01)。用藥后，澤瀉湯各劑量組和血脂康組PPARα和ACO mRNA的表達(dá)均強(qiáng)于模型組(P<0.01)。

3.4各組大鼠肝組織PPARα和ACO蛋白的表達(dá)如Fig 3所示，模型組大鼠PPARα和ACO的蛋白表達(dá)均弱于空白組(P<0.01)。用藥后，澤瀉湯各劑量組和血脂康組PPARα和ACO的蛋白表達(dá)均強(qiáng)于模型組(P<0.01)。

4 討論

Fig 1 Effects of RAD on histopathological changes of rat heart stained with HE

A: Control group; B Model group; C: H-RAD 21.0 g·kg-1group; D: L-RAD 10.5 g·kg-1group; E: XZK 0.2 g·kg-1group

Fig 2 Expression of PPARα mRNA and ACO mRNA in hepatic tissues of HLP rats(±s，n=10)

1: Control group; 2: Model group; 3: H-RAD 21.0 g·kg-1group; 4: L-RAD 10.5 g·kg-1group; 5: XZK 0.2 g·kg-1group.##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsmodel

Fig 3 The protein expression of PPARα and ACO in hepatic tissues of HLP rats(±s, n=10)

1: Control group; 2: Model group; 3: H-RAD 21.0 g·kg-1group; 4: L-RAD 10.5 g·kg-1group; 5: XZK 0.2 g·kg-1group.##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsmodel

高脂血癥為西醫(yī)病名，從中醫(yī)學(xué)的理論進(jìn)行分析，高脂血癥可歸屬“痰濁”、“血瘀”等范疇，尤其是與內(nèi)生痰濁關(guān)系密切。筆者認(rèn)為，高脂血癥的發(fā)病之所以呈逐年上升趨勢(shì)，其原因在于生活水平的提高，人們攝入過(guò)多的高脂高熱量食物；久坐(臥)少動(dòng)，身體缺乏鍛煉；工作壓力的增大和欲望的日益增多，情緒失衡，致使肝氣失于條暢等，漸至戧伐正氣，脾失健運(yùn)，肝失疏泄，氣血津液運(yùn)行失常，體內(nèi)津液的輸布或代謝出現(xiàn)障礙，則濕聚為飲生痰，痰濕脂濁稽留于里，注入血液，遂致血脂不斷升高。因此，脾虛痰濕內(nèi)盛為本病的主要病理基礎(chǔ)，健脾祛濕消痰為本病標(biāo)本兼治的有效方法。臨床資料表明[3]，澤瀉與白術(shù)作為高頻藥對(duì)應(yīng)用于臨床治療高脂血癥，取得了較好的治療效果。經(jīng)方澤瀉湯原主治“心下有支飲，其人苦冒眩”的病癥，從其組成分析，澤瀉功能利水滲濕消痰，白術(shù)有健脾燥濕利水之效，兩藥合用健脾、祛濕、化痰，與高脂血癥的發(fā)病機(jī)制頗為吻合，故選用其作為治療高脂血癥的基本方劑開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。

由于進(jìn)食過(guò)多的熱量，促進(jìn)TG的合成導(dǎo)致肥胖，而肥胖者體內(nèi)的脂肪堆積使脂肪分解更加活躍，釋放更多的游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)，血中FFA 增加引發(fā)血脂紊亂[5]。PPARs作為核受體超家族的一員，是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,有3種亞型，包括PPAR-α、PPAR-β/δ及PPAR-γ[6-7]。其中，PPARα在肝細(xì)胞中高水平表達(dá)，可參與眾多生化反應(yīng)及生物調(diào)節(jié)過(guò)程，調(diào)節(jié)脂類的攝取、氧化和脂肪的生成[8-9]，還可通過(guò)調(diào)控基因編碼線粒體脂肪酸β-氧化途徑保護(hù)心肌[10]。當(dāng)PPARα被活化后與配體形成異二聚體[11]，可調(diào)控參與脂代謝的多種基因編碼的蛋白質(zhì)，如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶、乙酰輔酶A氧化酶等[12]，從而介導(dǎo)TG和脂肪酸的分解代謝[13]。乙酰輔酶A氧化酶就是其中一個(gè)受PPARα調(diào)控的酶，也是β-氧化的關(guān)鍵酶，能增強(qiáng)β氧化，減少TG合成所需的乙酰輔酶A酯，進(jìn)而影響TG的合成。PPARα被激活后，可直接增加脂肪酸的氧化，減少脂肪的積聚，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14]，同時(shí)激活其下游基因ACO的表達(dá)，進(jìn)而減少TG的合成。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TC、TG、LDL含量均明顯升高，HDL含量及肝組織PPARα、ACO的基因和蛋白表達(dá)明顯降低；治療后，澤瀉湯各劑量組大鼠血清TC、TG、LDL含量明顯降低，而HDL含量及肝細(xì)胞PPARα和ACO的表達(dá)明顯升高，提示該方具有調(diào)節(jié)血脂作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)PPARα的表達(dá)，激活其下游基因ACO的表達(dá)，促進(jìn)脂肪氧化分解，減少脂質(zhì)合成，以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的目的，但其深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心開(kāi)展，感謝各位老師和同學(xué)的幫助與支持。)

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