多穗石柯葉提取物的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

陸武弟 楊仕婷 趙志文 梁耀元 韋能陸

【摘要】目的對(duì)多穗石柯葉乙醇提取物的急性毒性進(jìn)行研究，測(cè)定SD大鼠對(duì)多穗石柯葉乙醇提取物的最大耐受量（MTD）。

方法通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出多穗石柯葉乙醇提取物毒性不明顯，無(wú)法測(cè)定出半數(shù)致死量（LD50），故進(jìn)行最大耐受量（MTD）的測(cè)定。將大鼠分為提取物組和空白組，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h；灌胃，定時(shí)觀察并記錄大鼠毒性反應(yīng)和死亡情況，連續(xù)觀察14 d；每天稱量體重，第14天后將大鼠處死進(jìn)行解剖，觀察心、肺、肝、脾、腎等主要臟器的變化，稱量肝、脾重量。

結(jié)果提取物組大鼠的自主活動(dòng)、體重變化以及有關(guān)臟器重量的變化情況與空白組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），試驗(yàn)期間未出現(xiàn)大鼠死亡。SD大鼠對(duì)多穗石柯葉乙醇提取物的MTD為9.34 g提取物/kg。

結(jié)論多穗石柯葉乙醇提取物毒性較低，具有良好的食用安全性。

【關(guān)鍵詞】多穗石柯葉；急性毒性；最大耐受量

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.05.004

Experimental study of acute toxicity of extracts from leaves Lithocarpus polystachyus（DC.） Rehd

[HJ2][HJ]

LU Wudi1，YANG Shiting1，ZHAO Zhiwen1，LIANG Yaoyuan2，WEI Nenglu3，LI Jin4▲

（1.Undergraduate Class，Grade 2014 in College of Medical Laboratory，2.College of Basic Medicine，3.College of Pharmacy，4.Science and Technology Department，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China ）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo study the acute toxicity of the alcohol extracts from leaves of Lithocarpus polystachyus（DC.） Rehd，so as to measure the maximum tolerated does（MTD）of SD rats.

MethodsIn preliminary experiment，the alcohol extracts from leaves of Lithocarpus polystachyus（DC.） Rehd did not show obvious toxicity and the median lethal does（LD50）could not be measured.Therefore，the MTD was measured.Rats were divided into extract group and blank group.Before experiment，all rats were being fasted for 12 hours and fed with only water； they were given intragastric administration，then toxic reaction and death were observed and recorded regularly for continuous 14 d；rats were weighed everyday.14 days later，the rats were killed and dissected，the changes of main organs such as heart，lung，liver，spleen and kidney were observed，and liver and spleen were weighed.

ResultsThere was no statistically significant difference in autonomic activities，weight change and change of relevant organ weights between the blank group and the extract group（P>0.05）.No rat died during the experiment.The MTD of the alcohol extracts from leaves of Lithocarpus polystachyus（DC.） Rehd in SD rats was 9.34 g extract/kg.

ConclusionAlcohol extracts from leaves of Lithocarpus polystachyus（DC.） Rehd has low toxicity，which is safe for food.

【Key words】leaves of Lithocarpus polystachyus（DC.） Rehd；acute toxicity；MTD

多穗石柯為殼斗科石柯屬植物[1]，別名甜茶、甜葉子樹、大葉稠子、苷茶、多穗柯等，以野生形式零星分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)的低山密林中，其中以湖南中西部雪峰山一帶洞口、隆回花瑤瑤山地區(qū)產(chǎn)量最多。如今，我國(guó)的茶文化發(fā)展迅速，隨著人們生活水平的不斷提高，越來(lái)越多的茶葉在市場(chǎng)上暢銷，多穗石柯葉作為一種新興茶葉正式加入該行業(yè)。在以往的研究中，關(guān)于多穗石柯葉的研究文獻(xiàn)資料甚少。目前的文獻(xiàn)資料主要是對(duì)多穗石柯根皮苷成分[2]以及總黃酮測(cè)定等方面進(jìn)行相關(guān)報(bào)道，據(jù)李愛(ài)民等[3]研究發(fā)現(xiàn)多穗石柯有生津止渴、消除疲勞之功效，多穗石柯為野生植物，在自然狀態(tài)下植株高大、散生，采葉不便且產(chǎn)量有限，而多穗石柯葉作為一種新興茶葉，其在毒理實(shí)驗(yàn)方面的研究偏少，有關(guān)其急性毒性實(shí)驗(yàn)方面的文獻(xiàn)資料更是接近于零，這限制了其開發(fā)與利用。因此，本研究通過(guò)對(duì)多穗石柯葉乙醇提取物進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)研究，為其在飲品行業(yè)的發(fā)展與利用提供進(jìn)一步參考。endprint

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重18～22 g；健康SD大鼠30只，雌雄各半，體重（160±30）g，均購(gòu)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（桂）20120003。

1.1.2主要儀器

RE3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)A1104電子分析天平（上海天平儀器廠），HHS214電熱式恒溫水浴鍋（江蘇金壇宏凱儀器廠）。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥材及試劑

多穗石柯葉（購(gòu)于廣西百色鐿達(dá)茶葉有限責(zé)任公司），經(jīng)乙醇提取成浸膏，臨用前配置濃度為0.467 g/ml；99%乙醇（山東濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司），實(shí)驗(yàn)時(shí)配置成所需濃度；生理鹽水（規(guī)格：500 ml：4.5 g）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多穗石柯葉乙醇提取物的制備[4]

將干燥的多穗石柯葉粉碎至粉末后，準(zhǔn)確稱取200 g干粉，按照料液比1∶10加入85%乙醇溶劑，采用超聲波提取法回流提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，最后將濃縮液冷凍保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)配置成所需濃度即可。

1.2.2預(yù)實(shí)驗(yàn)[5]

選取10只健康SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，以苦味酸標(biāo)記后分開稱重并記錄相應(yīng)小鼠體重，禁食不禁水12 h后，給予灌胃可承受的體積0.4 ml/10 g體重，多穗石柯葉乙醇提取物的最大濃度為467 g/L，2次/d，每次間隔4 h，常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察1周。結(jié)果顯示：給藥后小鼠行動(dòng)較為遲緩，活動(dòng)減少，多數(shù)處于靜臥狀態(tài)，飲食、飲水量下降，1 h后恢復(fù)正常，觀察周期內(nèi)小鼠未出現(xiàn)死亡。無(wú)法測(cè)出該提取物的LD50，故進(jìn)行多穗石柯葉乙醇提取物的最大耐受量（MTD）的測(cè)定。

1.2.3MTD的測(cè)定[6]

選取健康SD大鼠30只，分為兩組：多穗石柯葉乙醇提取物組（提取物組）和空白組，每組15只，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食但不禁水12 h，提取物組以467 g/L（最高濃度）的藥液濃度，1 ml/100 g體重灌胃給藥，2次/d，每次間隔4 h，1 d內(nèi)給大鼠灌胃按含生藥量計(jì)算為9.34 g/kg的多穗石柯葉乙醇提取物，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)；空白組給予生理鹽水，連續(xù)觀察14 d。

1.2.4觀察項(xiàng)目

①給藥前稱量大鼠的體重，給藥后第2天起，每天稱量大鼠體重1次。②觀察給藥后大鼠的精神狀況、呼吸、食量、飲水量、大小便以及活動(dòng)和存活情況。③記錄各組大鼠的死亡情況，第14天后，處死大鼠，解剖觀察大鼠心、肝、肺、脾、腎、胃及小腸等器官的變化。④稱取大鼠肝、脾等臟器的重量并記錄。若有大鼠死亡，則立即解剖觀察其心、肝、肺、脾、腎、胃及小腸等器官的變化[7]。

1.3數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析處理各組數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠的一般反應(yīng)情況

大鼠灌胃多穗石柯葉乙醇提取物藥液后觀察時(shí)間為14 d，給藥后1 h內(nèi)多數(shù)大鼠活動(dòng)減少，多數(shù)處于靜臥狀態(tài)，個(gè)別偶有覓食及飲水現(xiàn)象，其余大鼠并未出現(xiàn)異常現(xiàn)象。給藥后第2天起，所有大鼠飲食、飲水皆正常，精神狀態(tài)正常，活動(dòng)并未出現(xiàn)異常，大小便也未見(jiàn)異常，14 d的觀察周期內(nèi)大鼠無(wú)死亡，皮毛光澤，體重增長(zhǎng)正常，空白組大鼠在觀察周期內(nèi)，飲食以及大小便等皆正常，體重增長(zhǎng)也正常。

2.2大鼠體重的變化

提取物組大鼠在灌服多穗石柯葉乙醇提取液后，其體重變化與空白組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3組內(nèi)不同時(shí)間大鼠體重變化的比較

空白組與提取物組內(nèi)不同時(shí)間大鼠體重兩兩比較的結(jié)果如表2所示，在空白組的兩兩比較中，第3、7、10、14天與第1天，第3、7、10天與第14天，第7天與第10天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在提取物組的兩兩比較中，第14天與第1、3、7、10天，第1天與第3天，第3天與第7天，第1天與第7、10天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4大鼠有關(guān)臟器的重量變化第14天解剖大鼠并肉眼觀察臟器，其肝、肺、脾、腎的大小、形狀、質(zhì)地、表面均正常，胃及小腸內(nèi)容物皆正常，其余未發(fā)現(xiàn)異常，且提取物組大鼠與空白組大鼠的臟器重量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.5最大耐受量SD大鼠對(duì)多穗石柯葉乙醇提取物的最大耐受量為9.34 g/kg。最大耐受量=藥液最大濃度×灌胃體積×灌胃次數(shù)，即0.467 g/ml×0.01 ml×2=0.00934 g；按含生藥量折算，大鼠的最大耐受量為9.34 g/kg。）

3討論

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重以及臟器重量變化結(jié)果分析

多穗石柯主要分布在長(zhǎng)江以南各省地區(qū)，野生自然狀態(tài)下采葉量有限，現(xiàn)如今，多穗石柯葉作為一種茶葉加入市場(chǎng)行業(yè)，目前的文獻(xiàn)資料[8～9]主要是對(duì)多穗石柯進(jìn)行相關(guān)報(bào)道：多穗石柯具有滋養(yǎng)肝腎和胃降逆、潤(rùn)肺止咳、解困醒酒等作用，但現(xiàn)代藥理學(xué)方面對(duì)于多穗石柯葉的研究文獻(xiàn)資料較少，對(duì)于其深層次的藥理作用缺乏更深的研究。近年來(lái)茶葉銷售量大幅增加，多穗石柯葉作為新興茶葉，容易引發(fā)公眾對(duì)其食用安全性的關(guān)注。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，SD大鼠灌胃給藥前后體重與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明給藥14 d內(nèi)多穗石柯葉乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重?zé)o影響；在不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)體重的比較中，給藥前的體重與給藥后4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的體重相比差異顯著，可能是由于實(shí)驗(yàn)實(shí)施的條件（例如足夠的食物和飲水）、時(shí)間以及SD大鼠自身?xiàng)l件等差異而導(dǎo)致大鼠的體重增長(zhǎng)較快。給藥14 d后處死大鼠并解剖觀察其肝、脾等臟器，比較結(jié)果顯示，給藥前后SD大鼠肝、脾重量與空白組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肉眼觀察未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變，顯示給藥14 d內(nèi)多穗石柯葉乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器無(wú)影響。endprint

3.2藥物最大耐受量根據(jù)我國(guó)現(xiàn)行的食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序?qū)Χ嗨胧氯~乙醇提取物的急性毒性作用進(jìn)行研究，了解其可能的毒性作用機(jī)制，確定其急性毒性的最大耐受量，從而為其合理使用提供安全性評(píng)價(jià)依據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示SD大鼠對(duì)多穗石柯葉乙醇提取物的最大耐受量為9.34 g/kg ，大于5 g/kg，按照中國(guó)食品毒理學(xué)急性毒性分級(jí)法標(biāo)準(zhǔn)，多穗石柯葉毒性較低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，表明多穗石柯葉具有較好的食用安全性。

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（收稿日期：2017-06-01修回日期：2017-07-19）

（編輯：潘明志）endprint