分子標記技術及其在益生菌分類中的應用

羅 游,田霄飛,王 露,夏楓耿,吳振強*

(1.華南理工大學 生物科學與工程學院,廣東 廣州 510006;2.廣州市微生物研究所,廣東 廣州 510663)

分子標記技術及其在益生菌分類中的應用

羅 游1,田霄飛1,王 露1,夏楓耿2,吳振強1*

(1.華南理工大學 生物科學與工程學院,廣東 廣州 510006;2.廣州市微生物研究所,廣東 廣州 510663)

益生菌的準確分類鑒定是益生菌應用于功能食品、藥品開發的前提。由于益生菌菌群結構的多樣性和復雜性,傳統方法如形態結構、培養特征試驗和生理生化試驗等對其組成的研究準確性低且耗時長。隨著分子生物學技術的發展,現代分子標記技術的應用為益生菌分類研究提供了一個新的方向。該文對常用的分子標記技術進行了概括包括分子雜交標記、PCR分子擴增標記和新型分子標記。以益生菌菌群分類鑒定為例,分析分子標記技術的基本原理、特點和現狀,為其進一步開發提供基礎。

益生菌;分子標記;鑒定;分類

益生菌是一類對宿主有益的微生物,具有調節腸胃失調、增強腸道免疫功能、抑制過敏反應和保護心血管系統的功能[1],能夠加強黏膜屏障、降低術后感染并發癥和降低“三高”等作用[2]。最常用的益生菌是乳酸菌(如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬)和酵母菌[3]。人體和動物體內存在多種菌群,菌群之間存在著非常復雜的關系。目前對益生菌作用的分子機制還不甚清楚[4],因此益生菌資源未能得到充分的開發利用。對不同益生菌菌株的篩選鑒定、生理生化特性研究以及應用安全性評估是近年來研究的重要組成部分。利用形態學、生理生化反應等特征對益生菌種類的鑒定存在操作繁雜、耗時長和準確度低等問題,而且無法對親緣關系較近的種進行鑒定[5]。然而,脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)分子標記技術的快速發展給微生物分類鑒定帶來了極大的便利。該技術能夠以電泳譜帶樣式的不同的形式直接表現生物個體或種群間基因組中特異性DNA片段的差異。目前已有幾十種基于DNA序列多態性的分子標記被開發和應用,主要分為三類:(1)以分子雜交為核心的分子標記,有限制性片段長度多態性標記和染色體原位雜交標記等;(2)以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)為核心的分子標記,有簡單重復序列、隨機擴增多態性DNA標記、擴展片段長度多態性標記和序列位點標記等;(3)新型的分子標記,有單核苷酸多態性標記和表達序列標簽等。本文對這些技術應用在益生菌分類鑒定方面進行系統論述。

1 以分子雜交為基礎的分子標記技術

1.1 限制性片段長度多態性標記

限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)即用不同的限制性內切酶在特定序列處切開DNA分子,產生限制性片段。先電泳分離DNA片段后,再經過Southern印跡技術把DNA片段轉移到硝酸纖維膜上。使用放射性標記探針與膜上DNA片段進行雜交,放射自顯影的DNA條帶圖譜展示了基因組的多態性。這項技術最初用于分離有性繁殖后代和構建其遺傳圖。RFLP分析中所使用的探針是隨機克隆的,與被檢測物具有一定同源性的cDNA片段或單拷貝或低拷貝基因組片段。RFLP遍布低拷貝編碼序列,且非常穩定。RFLP可以用來測定多態性是由父本還是母本產生的,也可用來測定由多態性產生的突變類型究竟是由堿基突變、倒位、缺失還是插入造成的。RFLP所產生的DNA指紋圖譜較適用于細菌種間及種內株間的分型鑒定。單用一種限制性內切酶所產生RFLP的條帶相似度較高,難以顯示個體間的遺傳信息差異。幾種限制性內切酶共同使用時可提高RFLP譜帶的分辨率,有效展示種內株間遺傳信息的差異[6]。此技術被認為是DNA指紋圖譜中有效的分型方法之一[7]。

益生菌的鑒定方法中,線粒體DNA與PCR相結合的RFLP分析法應用較多。這得益于mtDNA較小,適于進行限制性酶切分析。LOPES C A等[8]對從葡萄汁樣品中挑選出37株酵母進行了mtDNA和RFLP分析,把這些菌株分為9類。同時對篩選的酵母菌株MM f9進行了葡萄酒發酵試驗,通過RFLP分析和DNA多態性分析檢測了發酵前、中、后期的酵母菌群主要是漢遜酵母、畢赤酵母和釀酒酵母,這為篩選及鑒定優良葡萄酒酵母提供了可行的方法。IBRAHIM K等[9]使用PCR和RFLP方法對布基納法索四個地區的Rabilé(從高粱啤酒中獲得的干酵母)進行酵母菌株的分離和鑒定,分離出20株酵母菌,根據表型特征檢測出3個屬分別是假絲酵母(40%)、酵母菌(35%)和紅酵母(25%),并從酵母中分離鑒定出兩種特異菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和膠紅酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa),這表明Rabilé中土著酵母菌群的多樣性。ECATERINA L[10]從Apold地區的酒精發酵中分離出569株釀酒酵母,通過PCR-ITSRFLP方法鑒定了6種酵母菌株(A87、A169、A296、A314、A132和A413),其中菌株A87、A169、A296和A314是釀酒酵母,菌株A132和A413是貝酵母,鑒定的菌株是繁育土著釀酒酵母菌的基礎,以便獲得本地區正宗口味的葡萄酒。

1.2 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一種出現于20世紀70年代末的非放射性分子遺傳學實驗技術。其根據堿基互補配對原則,以熒光標記的寡核苷酸探針與目標DNA接合,最后用熒光顯微鏡即可直接觀察目標DNA所在的位置。雜交使用的探針一般使用放射性同位素標記,通過放射自顯影顯示雜交信號,雜交信號經酶聯顯色或熒光顯色得以顯示。FISH技術安全、快速、靈敏度高,探針能較長時間保存,能多色標記、簡單直觀,可用于中期染色體及間期細胞的分析,也可應用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標本、穿刺物和脫落細胞等多種物質的檢測。其缺點是不能達到100%雜交,特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降;分辨率低,只能檢測已知位點,通量較小,一次最多只能檢測5～8個位點。1989年首次使用熒光標記寡核苷酸探針檢測單個微生物細胞[11],20世紀90年代以后,FISH新的發展趨勢是由單色向多色發展。首先,WARD D C等[12]用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(acetyl fluorescein amino,AFA)標記探針建立了雙色熒光原位雜交技術,NEDERLOF P M等[13]隨后創建了多色熒光原位雜交技術,提出同時用3種熒光素探測3種以上靶位DNA序列,時至今日,已經發展出了用多種探針檢測的多色FISH。熒光原位雜交技術因其安全、準確、方便、實用等優點得到了廣泛的關注及應用。

目前熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridiza tion,FISH)已用于研究主要細菌群體的變化情況,LIKOTRAFITI E等[14]通過體外添加兩種益生菌(長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)和發酵乳桿菌(Lactobacillus fer mentum))和兩種益生元(異麥芽低聚糖(isomalto-oligosaccharide,IMO)和短鏈低聚果糖(fructo-oligosaccharide,FOS))等,對老年人的糞便微生物進行了培養,研究了雙歧桿菌(Bifidobacterium)和擬桿菌(Bacteroides)在腸道中的變化情況。FISH還被用于檢測天然乳清培養物中特定的乳酸菌[15]、牛奶制品中的乳酸菌[16]和發酵食品中益生菌雙歧桿菌定量分析[17]。

FISH能夠使用熒光顯微鏡或流式細胞儀直接枚舉環境樣品或其他混合群體中的全細菌細胞。近年來,在腸道微生物學方面已經進行了大量的FISH研究,主要集中在優勢細菌群體[18]。盡管FISH適用于優勢細菌種類鑒定并且使用相對容易,但該技術的檢測閾值限制了其在亞優勢菌群鑒定中的應用。另外,熒光探針的設計也是該技術推廣應用的限制性因素,廣泛的探針列表對于多樣性研究是很必要的。當有合適的探針時,只要混合群體中的細菌群體以106CFU/mL的水平存在,利用FISH技術就能準確檢測到該菌[19]。

2 以PCR反應為基礎的分子標記技術

隨著聚合酶鏈反應(PCR)技術的發展,基于PCR的分子標記方法相繼出現。特定的PCR引物,物種特異性引物組合,甚至菌株特異性PCR引物都在不斷發展[20]。以PCR為基礎的分子標記方法在不需要培養的條件下為細菌的識別和混合種群多樣性的研究提供了一個簡單快速的方法,為益生菌多樣性的快速和可靠質量控制提供了有力的工具[19]。

2.1 隨機擴增多態性DNA標記

隨機擴增DNA多態性分析(random amplified polymorphic DNA,RAPD)又被稱為任意引物PCR(arbitrary primed PCR,AP-PCR),是一種基于PCR的分子標記技術,其利用隨機引物或短引物退火到多個靶序列并針對形成益生菌種間差異的DNA條帶[21]。其理論依據是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點和數目可能不同,因而用一組人為設計的核苷酸作為引物,通過PCR隨機擴增可產生物種特異性的DNA譜帶。RAPD能夠在基因組序列未知的情況下分析微生物DNA的多態性,因此可以使用通用引物對種群進行分型分析。生成的RAPD譜帶由重復或獨特的序列組成,這些序列取決于模板DNA和所用引物序列之間的同源性。RAPD技術可用來分析各種微生物種間、亞種間乃至株間的親緣關系,另外,RAPD的PCR產物還能作為探針與Southern雜交技術結合,用于基因組或菌落雜交,能填補基因組的遺傳圖譜和物理圖譜間的空缺。該方法的主要缺點是分析結果取決于反應條件,因此可能在兩個不同的實驗室內出現不同的結果,并且由于每個引物擴增了基因組中的幾個離散基因座,因此不能區分雜合子和純合子[22]。

很多研究小組已經證實RAPD技術在區分鑒別大多數乳酸桿菌[23]和雙歧桿菌[24]的種間差異是可靠的。隨著16S rRNA基因測序的發展,RAPD被認為是使用最廣泛的食品相關的乳酸桿菌的分型技術,重RAPD(RAPD與多個隨機引物)已成功地用于分類鑒別乳酸菌[25],并已被證明能準確區分戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)[26]。RAPD也被用于區分16S rDNA相似的菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)[27]。RAPD是產生具有不同特異性的分類群特異性標記物的有力工具,已被開發用于鑒定嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilic)和乳桿菌屬(Lactobacillus)[28]。JASMINE K等[29]通過設計RAPD引物,從蔬菜和其他食品中分離并鑒定的37株細菌,很多其他研究也已表明利用RAPD-PCR技術成功對多種乳酸菌進行了分離鑒定,結果表明,該技術適用于初步分離鑒定和表征細菌。

2.2 簡單重復序列分子標記

簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)又稱為微衛星DNA(microsatellite DNA)或簡單的串聯重復序列(short tandem repeats,STR),是以1～6個核苷酸為單位多次串聯的重復序列,重復次數10～20次不等。串聯重復單元數量的變化主要是由于DNA復制過程中的鏈條滑移,其中允許通過重復切除或添加重復單元進行匹配。簡單重復序列根據其兩端的保守序列設計一對特異性引物,PCR擴增,再經聚丙烯酰胺凝膠電泳就可顯示不同基因型個體在這個SSR位點的多態性[30]。

SCHULLER D等[31]從葡萄酒中分離出361株酵母菌,用mtDNA進行限制性酶切,6個微衛星引物進行PCR擴增。研究得出葡萄酒發酵過程中的優勢菌株是釀酒酵母(Sac charomyces cerevisiae)和貝酵母(Saccharomyces bayanus)。LAITILA A等[32]對麥芽糖生產過程中分離的700株酵母菌株,運用SSR引物進行分析,鑒定出了25種子囊菌酵母和18種擔子菌酵母。SSR是一種新興技術,對于遺傳多樣性的檢測,這些微衛星已經成為分子標記的可選序列。據此可以將遺傳型不同的菌株快速挑選出來,以方便遺傳型相同菌株的歸類分析,并且可避免重復鑒定,減少生化和遺傳鑒定工作量。

2.3 內部簡單重復序列分子標記

1994年,ZIETKIEWICZ E等[33]建立內部簡單重復序列分子標記方法(inter simple sequence repeats,ISSR),其是在微衛星分子標記基礎上發展起來的。把人工合成的16～18個核苷酸重復序列作為引物,對SSR之間的DNA序列進行PCR擴增。較SSR、ISSR在引物設計上簡單許多,該引物由重復的二、三、四或五核苷酸基序的核心序列組成,無需知道DNA序列就可用引物進行擴增,還比RFLP、RAPD、SSR提供的遺傳信息更多。如今ISSR在遺傳作圖、遺傳多樣性、基因定位、進化和系統發育等方面被廣泛使用。

GALLARDO G等[34]應用ISSR-PCR鑒定和區分干燥伊比利亞火腿中的酵母,并且能快速鑒別出漢遜酵母株。FABIO M等[35]應用ISSR-PCR對用于制作傳統/典型意大利面包的19個酸面團中的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)和酵母微生物群進行分析,鑒定結果表明最常見的乳酸菌是乳酸乳桿菌(約占總LAB分離株的28%)、植物乳桿菌(約16%)和干酪乳桿菌(約14%)。酵母菌群中假絲酵母(Candida humilis)、Kazachstania barnettii和 Kazachstania exigua被鑒定出來。

與SSR標記相比最大的差別可能就是ISSR引物可以在不同的物種間通用,而SSR標記具有較強的物種特異性。

2.4 擴增片段長度多態性分析

1993年,ZABEAU M等[36]建立了擴增片段長度多態性分析技術(amplified fragment length polymorphism,AFLP)。AFLP是RFLP和RAPD技術的結合,基本原理是通過PCR選擇性地擴增整個DNA的內切酶片段,在聚丙烯酰胺凝膠上電泳,產生一組特異的DNA限制性片段的譜圖[37]。

AFLP分析廣泛應用于遺傳圖譜構建、基因定位、種質資源鑒定、分子系統和群體遺傳學等方面。這種方法也被用于區分系統發育密切相關的菌株戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和假乳酸桿菌(Lactobacillus pseudoplantarum)[20],另外,該技術用于乳桿菌和雙歧桿菌亞種的菌株特異性鑒定[38]。AFLP衍生的標記物已用于鑒定和表征不同來源的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)[39]。

AFLP是在RFLP、SSR和RAPD之后發展最快的DNA指紋技術,其結合了RFLP的可靠性和嚴格的PCR退火條件,有高度特異性,既克服了RFLP技術中Southern雜交的煩瑣和耗時的缺點。與RAPD-PCR相比,其在基因組水平上具有更好的再現性、更高的分辨率和靈敏度,同時該方法能夠用于鑒別親緣關系較近種以及亞種[40]。

2.5 放大剪切序列多態性分子標記

1993年,在RAPD技術的基礎上Paran建立了放大剪切序列多態性標記(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)。CAPS技術提供了一種利用映射RFLP標記物的DNA序列,以開發基于PCR的標記從而省去了繁瑣的DNA印跡。CAPS技術闡明了單個堿基變化引起的限制性片段長度多態性,如單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)、堿基的插入或缺失,從而修飾PCR擴增子中的限制性內切核酸酶的識別位點[41]。引物的合成設計是基于數據庫中基因組的序列信息或cDNA序列以及克隆的RAPD條帶序列。CAPS的PCR擴增產物通過限制酶剪切,產生與傳統RFLP相同類型的數據。CAPS已成功應用于釀酒酵母菌株的遺傳鑒定和鑒別,通過獲得的遺傳圖譜分析和確定多態性程度、遺傳多樣性和菌株之間的聯系[42]。CAPS分析是多功能的,可以與單鏈構象多態性、SCAR、AFLP或RAPD相結合,以增加發現DNA多態性的可能性。CARS標記具有使用的引物長、穩定高和試驗的可重復性高等優點[43]。

3 新型分子標記技術

3.1 單核苷酸多態性

單核苷酸多態性(SNP)是當基因組(或其他共享序列)中的單個核苷酸A、T、C或G在生物物種或配對染色體的成員之間發生的DNA序列變異,主要表現為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性,由突變使得個體之間和群體之間產生了差異。SNP在基因組非編碼區中更為普遍,在編碼區內要么是非同義密碼子導致氨基酸序列的變化,或是同義密碼子不改變氨基酸序列。SNP遍布于整個人類基因組中,根據SNP在基因中的位置,可分為基因編碼區、基因周邊和基因間三類[44]。SNP具有數量多、分布廣泛、檢測快速和利于發展自動化篩選等優勢,并且具有更高的遺傳穩定性,尤其是處于編碼區的SNP。

BARRANGOU R等[45]鑒別了2株動物雙歧桿菌亞種(Bifidobacterium animalissubsp.)全序列中的47個SNPs,以便深入了解這一物種的潛在功能和進化多樣性,依據這2株菌的SNPs大小及數量,這些菌株被區分為1 268至304 414代[46]。DOUILLARD F P等[47]在基因組和表型水平上鑒定了4種市面銷售益生菌的菌株,從Vifit和Idoform益生菌產品分離的鼠李糖桿菌菌株(L.rhamnosus)的基因組中的SNP的鑒定表明可能存在突變的熱點。

3.2 表達序列標簽

表達序列標簽(expressed sequence tags,EST)指分離部分cDNA,一般長度為300～500 bp。EST是一種快速、劃算的基于轉錄組的基因發現方法,已成為識別生物體內編碼區域的一種有效方法[48]。目前,用到的含有ESTs子數據庫分別是美國國立生物技術信息中心(National Center For Biotechnology Information,NCBI)的GenBank、歐洲分子生物實驗室的(EuropeanMolecular BiologyLaboratory,EMBL)和日本國家數據庫(DnaDataBankofJapan,DDBJ)。

雖然比較基因組學可以幫助確定基因,并且有可能鑒定以前被忽視的基因和糾正酵母基因組中的錯誤,但酵母或高等真核生物中的啟動子預測和轉錄起始仍然是困難。對于釀酒酵母(S.cerevisiae),現僅有有限數量的cDNA序列產生,其中3 000個表達序列標簽和cDNA可通過GenBank獲得。EST為真菌提供了有效的工具,用于進一步研究基因表達,包括作為轉錄實驗中的探針[49]。

EST技術已應用在分離與鑒定新基因、基因的定位克隆、基因差異表達的研究、制備cDNA芯片和構建遺傳學圖譜等方面。EST技術所獲得的基因組信息不全面像調控序列、內含子等在基因表達調控中起重要作用的信息沒有體現出來,以及在高表達和中表達豐度基因的EST存在冗余性,測序成本增加。

隨著知識和信息的不斷發展完善,分子標記技術一直在改進,新的分子標記技術相繼出現。在對益生菌分類研究時,應根據要所研究生物類群的遺傳背景和解決的問題選擇合適的分子標記技術。

4 展望

在益生菌的分類鑒定研究工作中,DNA分子標記技術可被廣泛使用,但各種方法各有其優勢和一定的缺陷。在鑒定一個新種時,需要應用多個指標或多種方法綜合分析所得的結果才能獲得正確結論。

基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學等學科的不斷發展,為益生菌的系統研究提供了新的思路和方向,不再是簡單的描述種群多樣性或證明有機體是否存在,而是能夠揭示微生物群落和益生菌菌株在活體生物中扮演的功能角色,同時闡明益生菌對活體生物的真實影響,在此基礎上能更準確地評價和篩選具有特定功能的益生菌,為研究益生機制提供了可靠的手段和技術。隨著分子生物學理論與技術進一步的發展完善,必將開發出分析速度更快、信息量更大、準確度更高、成本更低的分子標記技術,DNA分子標記技術在益生菌分類研究中必將具有更大的應用空間。

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LUO You1,TIAN Xiaofei1,WANG Lu1,XIA Fenggeng2,WU Zhenqiang1*
(1.School of Biology and Biological Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China;2.Guangzhou Institute of Microbiology,Guangzhou 510663,China)

TS201.3

0254-5071(2017)11-0001-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.001

2017-07-19

廣州市科技計劃項目-產學研協同創新重大專項(201604046011)

羅 游(1992-),女,博士研究生,研究方向為發酵工程。

*通訊作者:劉功良(1980-),男,副教授,博士,研究方向為發酵工程。