噪聲對肉鴨內臟組織熱休克蛋白mRNA轉錄的影響

張 揚，陳博雯，卞友慶，王兆山， 徐 琪，常國斌，陳國宏，*

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇現代畜牧科技園，江蘇 泰州225300；3.江蘇益客食品有限公司，江蘇 宿遷 223800)

噪聲對肉鴨內臟組織熱休克蛋白mRNA轉錄的影響

張 揚1，陳博雯1，卞友慶2，王兆山3， 徐 琪1，常國斌1，陳國宏1，*

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇現代畜牧科技園，江蘇 泰州225300；3.江蘇益客食品有限公司，江蘇 宿遷 223800)

為闡明噪聲對肉鴨的生理影響，提高肉鴨的動物福利，試驗將60只北京鴨隨機分成3組，利用噪聲發生器進行80 dB(處理組1)和100 dB(處理組2)的噪聲應激，對照組不進行應激。應激結束后采集肝臟、脾臟、肺和腎臟組織，采用RT-PCR技術檢測各組織中HSP70、HSP90 mRNA轉錄水平。結果顯示：處理組鴨肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等4個組織中HSP70、HSP90 mRNA的轉錄水平極顯著(P<0.01)高于對照組，且處理組2的HSP70、HSP90 mRNA的轉錄水平極顯著(P<0.01)高于處理組1。表明急性噪聲應激會使得肉鴨內臟組織的HSPs mRNA轉錄增加。

噪聲應激；肉鴨；HSP70；HSP90

隨著集約化高密度飼養模式的廣泛應用，家禽在飼養過程中對各種應激的敏感性逐漸增強，加上近年來H7N9事件的發生，活禽市場紛紛關閉，肉鴨集中屠宰已成必然，而在屠宰場，往往伴隨著強烈的噪聲。噪聲對于動物來說是一種潛在的應激源。早在1978年已有噪聲對動物健康有顯著的負面影響的報道[1]，并且有大量的研究已經證實噪聲對于豬、牛和人等都有強烈的應激[2-4]。從表面上來看噪聲會對家禽的生產性能和行為產生不利的影響，但關于噪聲作為應激源在家禽(特別是水禽)上的研究卻很少。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是細胞受到各種理化因素刺激后誘導機體產生的一組保護性蛋白，這些蛋白廣泛存在于生物界的原核及真核生物細胞中，具有高度保守性。在應激狀態下HSPs的量發生劇烈變化，保護組織細胞免受損傷，因此HSPs的表達水平可以作為一個潛在的環境應激的生物標志物[5]。HSP70是HSPs含量最多、最重要的分子之一，它具有分子伴侶作用、抗氧化作用、抗細胞凋亡、增加熱耐受和參與細胞周期調控等多種生物學功能[6]；HSP90也是HSP家族中重要成員之一，在應激損傷、腫瘤、自身免疫性等疾病治療中發揮重要作用[7]。本研究以北京鴨為試驗對象，模擬屠宰場急性噪聲強度，利用Real-time PCR技術測定噪聲應激后鴨內臟組織的HSP70、HSP90 mRNA的轉錄水平，探討急性噪聲應激對HSPs mRNA轉錄水平的影響，旨在為進一步研究減少肉鴨屠宰應激、提高動物福利提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和飼養管理

選取1日齡健康的北京鴨60只，隨機分為3個組：80 dB的噪聲應激20 min(處理組1)、100 dB的噪聲應激20 min(處理組2)和對照組，每個組設4個重復，每個重復5只。試驗肉鴨采用室內圈養，飼養管理按《瘦肉型商品代北京鴨飼養管理規程》進行。

1.2 噪聲應激試驗

42日齡出欄時進行應激，噪聲應激前不禁食不禁水。利用噪聲發生器(型號TD0005，民泰儀器行)對處理組1、處理組2分別進行80 dB和100 dB的噪聲應激，應激持續20 min。

1.3 樣品制備

應激結束后采用頸部放血法屠宰肉鴨并迅速采取肝臟、脾臟、肺和腎臟等組織于液氮中冷凍，帶回實驗室，置于超低溫冰箱保存備用。

1.4 試驗試劑

RNA抽提試劑購自生工生物工程(上海)有限公司；反轉錄與PCR試劑購于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.5 引物設計

參照GenBank中關于紹興鴨HSP70、HSP90的引物序列和鴨GAPDH(登錄號：AY436595.1)設計實時熒光定量PCR引物：

qHSP70 F: 5′-CCCCCAGATCGAGGTTACTTT-3′；

qHSP70 R: 5′-CTCCCACCCGATCTCTGTTG-3′。

qHSP90 F: 5′-CCTTCAGCTGCTGCACACA-3′；

qHSP90 R: 5′-CGCATCTGGTGATGAAATGG-3′。

β-actinF: 5′-ATGTCGCCCTGGATTTCG-3′；

β-actinR: 5′-CACAGGACTCCATACCCAAGAA-3′。

1.6 RT-PCR 反應

采用Trizol法抽提各組織RNA，cDNA的合成總反應體系：10×Fast RT Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix 2 μL，FQ-RT Primer Mix 4 μL，Rnase-Free ddH2O 補足至20 μL。反應條件為42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，4 ℃保存。將得到的cDNA模板按10倍梯度稀釋后，計算每對引物PCR擴增效率，實時熒光定量操作參照TaKaRa試劑盒說明書進行。

1.7 數據處理

試驗數據分析采用SPSS16.0單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗，數據用平均值±標準差(mean±sd)表示，并采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1噪聲應激對HSP70 mRNA轉錄水平的影響

由圖1可知，經80 dB噪聲應激20 min后，肝臟、脾臟、肺和腎臟等4個組織的HSP70 mRNA的轉錄水平都比空白組要極顯著提高(P<0.01)；100 dB噪聲應激20 min后，上述4個組織的HSP70 mRNA的轉錄水平極顯著高于80 dB噪聲應激組和對照組(P<0.01)。

2.2噪聲應激對肉鴨內臟組織HSP90 mRNA轉錄水平的影響

由圖2可知，在80 dB的噪聲應激下，處理組1與處理組2的肉鴨肝臟、脾臟、肺和腎臟4個組織中的HSP90 mRNA的轉錄水平都極顯著高于對照組(P<0.01)，且處理組2極顯著高于處理組1，即在100 dB的噪聲應激下，4個組織的HSP90 mRNA的轉錄水平極顯著高于80 dB噪聲應激組。

**表示差異極顯著(P<0.01)。下同**showed extremely significant difference (P<0.01). The same as bellow圖1 噪聲應激對肉鴨內臟組織HSP70 mRNA轉錄水平的影響Fig.1 Influence of noise on HSP70 mRNA transcription in internal organs of meat duck

圖2 噪聲應激對肉鴨內臟組織HSP90 mRNA轉錄水平的影響Fig.2 Influence of noise on HSP90 mRNA transcription in internal organs of meat duck

3 討論

本試驗結果表明，在80 dB和100 dB的噪聲應激20 min后，肉鴨的肝臟、脾臟、肺和腎臟等4個組織的HSP70 mRNA的轉錄水平極顯著(P<0.01)升高，這跟在肉雞上獲得的研究結果一致[8]。HSP70 mRNA的表達產物HSP70可作為抗原分子載體，也可誘導HSP的產生并協同參與抗原加工、呈遞，并利用自身的抗原特異性為T細胞免疫識別導航[9]。現在一般認為HSP70的高表達有利于動物的自我保護機能，增強對外界不良刺激的抵抗力[10-11]。本試驗結果充分表明，肉鴨經急性噪聲應激后可對組織產生一定影響，并引起HSP70表達量的變化。HSP90的高表達可維持機體應激條件下細胞必需的蛋白質構象，對緩解應激引起的細胞損害起著重要作用[12]。在本試驗中，4個組織的HSP90 mRNA在應激條件下轉錄水平都極顯著上升，也與在肉雞的研究結果一致[13]。

綜上所述，急性噪聲應激可對鴨內臟組織細胞產生一定損傷，導致HSP70和HSP90 mRNA表達水平的升高，噪聲強度越大，HSP70和HSP90 mRNA的表達水平越高，這提示我們肉鴨在宰前應避免高噪聲應激，以免對機體產生損傷。本研究結果為進一步研究減少肉鴨生產應激、提高動物福利提供了一定的數據支持。

[1] ALGERS B， EKESBO I， SROMBERG S. The impact of continuous noise on animal health[J].ActaVeterinariaScandinavicaSupplementum， 1978， 19(67)：1-26.

[2] WAYNERT D F， STOOKEY J M， SCHWARTZKOPF-GENSWEIN K S， et al. The response of beef cattle to noise during handling[J].AppliedAnimalBehaviourScience， 1999， 62(1)：27-42.

[3] MOLINO， J A. Annoyance and noise [M]// HARRIS C M. Handbook of noise control [M]. [S.l.]: McGraw-Hill， 1979， 26(4)：41-51.

[4] MELAMED S， BRUHIS S. The effects of chronic industrial noise exposure on urinary cortisol， fatigue and irritability: a controlled field experiment[J].JournalofOccupational&EnvironmentalMedicine， 1996， 38(3):252-256.

[5] 王同國，史斌. 熱休克蛋白調控的研究進展[J]. 現代免疫學，2007，27(1)：73-76.

WANG T G， SHI B. The research progress of heat shock protein regulation[J].ModernImmunology， 2007， 27(1)：73-76. (in Chinese)

[6] 萬莉莉，胡明華，史紹蓉，等. 運動應激狀態下的心肌熱休克蛋白表達[J]. 中國組織工程研究，2014，18(38)：6216-6221.

WAN L L， HU M H， SHI S R， et al. Expression of myocardial heat shock protein under stress state[J].ChineseJournalofTissueEngineeringResearch， 2014， 18(38)：6216-6221. (in Chinese with English abstract)

[7] 羅靖旻，羅建新. 熱休克蛋白免疫作用的研究進展[J]. 醫學綜述，2013，19(7)：1179-1181.

LUO J M， LUO J X.Research progress of the immunity of heat shock proteins[J].MedicalRecapitulate， 2013， 19(7)：1179-1181.(in Chinese with English abstract)

[8] 許生友，陳興勇，姜潤深，等. 肉雞熱應激下肝臟和下丘腦HSP70 mRNA的表達[J]. 中國農學大學學報，2011，6(3)：112-116.

XU S Y， CHEN X Y， JIANG R S， et al. Expression of HSP70 mRNA in liver and hypothalamus in chicken under heat stress[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity， 2011， 6(3)：112-116. (in Chinese with English abstract)

[9] 計紅，吳永魁，胡仲明，等. 不同強度冷應激下仔豬淋巴細胞HSP70 mRNA的轉錄規律[J]. 應用與環境生物學報，2007，13(4) ：507-509.

JI H， WU Y K， HU Z M， et al. HSP70 mRNA transcription in lymphocyte of piglets under cold stress with different intensities[J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentalBiology， 2007， 13(4) ：507-509. (in Chinese with English abstract)

[10] JI H， WU Y K， GUO J R， et al. Effects of cold stress on expression ofHsp70 gene in blood lymphocyte of piglets[J].JournalofAnimal&VeterinaryAdvances， 2012， 11(21)：3914-3920.

[11] MOSSER D D， CARON A W， BOURGET L， et al. Role of the human heat shock protein HSP70 in protection against stress-induced apoptosis[J].MolecularandCellularBiology， 1997， 17(9)：5317-5327.

[12] TANG M T， SUN M， LU M X， et al. Expression patterns of five heat shock proteins inSesamiainferens(Lepidoptera: Noctuidae) during heat stress[J].JournalofAsia-PacificEntomology， 2015， 18(3)：529-533.

[13] 雷蕾. 肉雞組織的熱應激損傷與HSP90水平及其mRNA表達的變化 [D]. 南京：南京農業大學，2008:9-15

LEI L. Corresponding mRNA in the heat-stressed broilers [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University， 2008:9-15. (in Chinese with English abstract)

(責任編輯盧福莊)

InfluenceofnoiseonHSPsmRNAtranscriptionininternalorgansofmeatduck

ZHANG Yang1， CHEN Bowen1， BIAN Youqing2， WANG Zhaoshan3， XU Qi1， CHANG Guobin1， CHEN Guohong1，*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China; 2.JiangsuModernAnimalHusbandryScienceandTechnologyPark，Taizhou225300，China; 3.JiangsuEcoFoodCo.，Ltd，Suqian223800，China)

In order to clarify the physiological effects of noise on meat ducks and improve the animal welfare of meat ducks， 60 ducks were randomly divided into 3 groups. The 80 and 100 dB noise were applied by noise generator to establish stress model in experimental group 1 and 2， respectively. The control group did not apply noise stress. Liver， spleen， lung and kidney tissues were collected after the stress treatment. RT-PCR was used to detect the expression of HSP70 and HSP90 mRNA in each tissue. The results showed that transcription levels of HSP70 and HSP90 mRNA in the liver， spleen， lung and kidney of experimental group 1 and 2 were significantly higher than those in the control group (P<0.01)， and the transcription levels of HSP70 and HSP90 mRNA in experimental group 2 were significantly (P<0.01) higher than those in experimental group 1. Therefore， acute noise stress would increase the transcript of HSPs mRNA in the internal organs of meat ducks.

noise stress; meat duck; HSP70; HSP90

張揚，陳博雯，卞友慶，等.噪聲對肉鴨內臟組織熱休克蛋白mRNA轉錄的影響[J]. 浙江農業學報，2017，29(11): 1796-1799.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.04

2017-04-01

江蘇省農業科技自主創新資金項目[CX(15)1010;CX(14)2070]；江蘇省高校自然科學研究項目(16KJB230002)

張揚(1986—)，男，山東臨沂人，博士，講師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：zyang@yzu.edu.cn

*通信作者，陳國宏，E-mail：ghchen@yzu.edu.cn

S834；X121

A

1004-1524(2017)11-1796-04