葛根素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖凋亡的影響

劉銀莉,王 營

葛根素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖凋亡的影響

劉銀莉1,王 營2*

目的探討葛根素對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的作用及其機制。方法取對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞，分別用不同濃度的葛根素(0、50、100、200 μmol/L)干預(yù)48 h后，利用CCK-8檢測PANC-1細(xì)胞增殖水平；Annexinv-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Western blot檢測Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、Caspase-7表達水平。結(jié)果葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的抑制呈濃度依賴性；不同濃度的葛根素干預(yù)PANC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為2.47%±0.64%、6.37%±0.71%、8.33%±0.90%、12.40%±1.01%，實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Western blot實驗表明，葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞干預(yù)48 h后，隨著葛根素濃度的增加，細(xì)胞中Fas、Fas-L、Caspase-7、Bax蛋白的表達量上調(diào)，Bcl-2的表達量下調(diào)，實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論葛根素可通過激活Fas/Fas-L信號通路誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞增殖抑制和凋亡。

葛根素；PANC-1細(xì)胞；增殖；凋亡；Fas/Fas-L

0 引言

胰腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌的死亡率與發(fā)病率的比例為0.99∶1。在我國，近十年來胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第6～7位[1]。胰腺癌患者的中位生存時間為3～5個月，1年生存率<10%[2]。該病早期不易發(fā)現(xiàn)、無化學(xué)預(yù)防手段、早期易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，80%以上的胰腺癌就診時已無法手術(shù)切除。葛根素是從豆科葛屬植物野葛、甘葛藤根中提取的一種異黃酮苷成分,臨床上主要用于心腦血管疾病，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、心肌梗死；缺血性腦血管病，如腦血管痙攣；眼底病，如視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、視神經(jīng)萎縮等。近年來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤方面發(fā)揮一定的作用[3-5]。本文以胰腺癌為靶細(xì)胞，初步探討葛根素對人胰腺癌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1(徐州醫(yī)科大學(xué)消化科實驗室凍存)；葛根素(上海源葉生物科技有限公司，批號：B20446，純度>99%)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)；DMSO(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；6孔培養(yǎng)板(美國Thermo公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Thermo公司)；CCK-8試劑盒(微科曼得生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/P雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司，貨號：KGA107)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基生物公司，貨號：KGA512)；GAPDH抗體(美國CST公司)；Fas抗體(美國Affinity公司)；Fas-L抗體(美國Affinity公司)；Bcl-2抗體(英國Abcam公司)；Bax抗體(英國Abcam公司)；Caspase-7(美國CST公司)；RIPA蛋白裂解液(強)、蛋白酶抑制劑cocktail、Western blot凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 儀器 恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；SEAC全自動酶標(biāo)儀(北京西亞克技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinso公司)；Western blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的PANC-1細(xì)胞解凍后，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，加入青霉素(100 U·mL/L)和鏈霉素(100 U·mL/L)，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d更換培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞約80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.3.2 CCK8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4×104/mL，接種到96孔板，每孔200 μL，24 h后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，每孔分別加入100 μL不同濃度(0、50、100、200 μmol/L)的葛根素溶液、0.5% DMSO溶劑，每組設(shè)5個復(fù)孔，并分別以PBS液為空白對照，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄上清，每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀測定在450 nm處每孔的吸光光度值(OD)，并根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(實驗組OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)。本實驗步驟重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105/mL的PANC-1細(xì)胞密度接種到6孔板，24 h后加入不同濃度的葛根素(0、50、100、200 μmol/L)，常規(guī)條件(37 ℃、5% CO2飽和濕度)下培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞并用PBS沖洗，根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，上機測定凋亡率。

1.3.4 Western blot檢測Fas/Fas-L信號通路相關(guān)蛋白的表達 實驗分為4個組：空白對照組，50、100、200 μmol/L葛根素給藥組。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，常規(guī)行10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至活化的PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加一抗Fas(1∶1 000)、Fas-L(1∶1 000)、Caspase-7(1∶1 000)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、GAPDH(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。TBST溶液洗膜3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶8 000)，室溫孵育l h，ECL法發(fā)光顯色。GAPDH作為內(nèi)參照。計算機掃描圖像，檢測各條帶面積灰度值，以各組目的蛋白與自身GAPDH灰度值比值作為各組細(xì)胞中蛋白的相對含量。每組樣本重復(fù)檢測3次。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示：溶劑對照組(0.5% DMSO)對胰腺癌PANC-1細(xì)胞的抑制作用與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明0.5% DMSO對胰腺癌PANC-1無增殖抑制作用。不同濃度的葛根素(0、50、100、200 μmol/L)作用于胰腺癌PANC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為0、13.83%±0.03%、36.94%±0.03%、62.00%±0.08%。見圖1。

圖1 葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的抑制率注：與葛根素0 μmol/L比較，**P<0.01

2.2 葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的影響 流式雙染法(Annexin V-FITCI和PI)檢測結(jié)果見圖2、表1。結(jié)果顯示，經(jīng)0、50、100、200 μmol/L葛根素處理PANC-1細(xì)胞48 h后，隨著葛根素藥物濃度的增加，PANC-1細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明葛根素能夠濃度依賴性地誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞的凋亡率(48 h)

表1 葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的影響(48 h，n=3)

注：與葛根素0 μmol/L比較，**P<0.01

2.3 葛根素對PANC-1細(xì)胞Fas/Fas-L信號通路的影響 葛根素(0、50、100、200 μmol/L)作用于胰腺癌PANC-1細(xì)胞48 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，隨著葛根素濃度的增加，胰腺癌PANC-1細(xì)胞中Fas、Fas-L、Caspase-7蛋白的表達水平升高，實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此推斷葛根素誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡可能是通過激活Fas/Fas-L信號通路，上調(diào)Fas、Fas-L、Caspase-7蛋白的表達實現(xiàn)的。見圖3、表2。

圖3 Western blot檢測葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞Fas、 Fas-L、Caspase-7蛋白表達的影響(48 h)

2.4 葛根素對PANC-1細(xì)胞Bax和Bcl-2的影響 不同濃度葛根素(0、50、100、200 μmol/L)作用于胰腺癌PANC-1細(xì)胞48 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，隨著葛根素濃度的增加，胰腺癌PANC-1細(xì)胞中Bax蛋白的表達水平增加，Bcl-2蛋白的表達水平下降，實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。可見葛根素可以通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白的表達，影響線粒體膜電位的改變，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖4、表2。

圖4 Western blot檢測葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞Bax、 Bcl-2蛋白表達的影響(48 h)

3 討論

既往大量研究表明，葛根素對多種腫瘤具有抗腫瘤作用，但查閱大量國內(nèi)外文獻可知，葛根素對胰腺癌的抗腫瘤作用尚未見報道，因此，本實驗旨在通過體外實驗研究葛根素對胰腺癌是否具有抗腫瘤作用。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，葛根素對胰腺癌PANC-1細(xì)胞具有增殖抑制作用，且具有濃度依賴性；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，隨著葛根素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，目前研究表明，主要有兩條途徑涉及凋亡過程：細(xì)胞膜上的死亡受體途徑和細(xì)胞內(nèi)的線粒體途徑[6]。其中，在死亡受體途徑中最具代表性的是Fas/Fas-L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由325個氨基酸組成，廣泛存在于人體各種組織和細(xì)胞中。Fas-L是一種Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達在細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、免疫豁免區(qū)和各種腫瘤細(xì)胞表面。Fas-L作為Fas的配體，能與Fas結(jié)合啟動細(xì)胞的程序性死亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as表達上調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Fas結(jié)構(gòu)域自發(fā)齊聚，和獨立的Fas-L結(jié)合后引起Fas過表達，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。同樣，F(xiàn)as和Fas-L也能夠彼此獨立地啟動凋亡進程。Fas-L本身可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，從而引起細(xì)胞凋亡。此外，F(xiàn)as或Fas-L上調(diào)能增加和受體連接的幾率，啟動包括Caspase-7、Caspase-3在內(nèi)的Caspases的級聯(lián)反應(yīng)。Caspases是一群結(jié)構(gòu)類似的蛋白酶族，是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，細(xì)胞凋亡程度與其表達水平的高低有關(guān)[9]。Caspases蛋白酶類包括凋亡的起始者和執(zhí)行者，其能夠在多個細(xì)胞系中被激活[10]。Caspase-7是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，與Caspase-3共同被認(rèn)為是凋亡的最終執(zhí)行者。

表2 不同濃度的葛根素作用于PANC-1細(xì)胞后Fas、Fas-L、Caspase-7、Bax、Bcl-2蛋白表達量與內(nèi)參比值的變化(48 h，n=3)

注：與葛根素0 μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01

研究表明，F(xiàn)as-L可以表達在胰腺癌細(xì)胞中[11]。李偉良[12]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素對人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞Fas、Fas-L蛋白表達具有一定影響，葛根素處理后較處理前人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞Fas、Fas-L蛋白表達水平明顯升高，但無濃度依賴性。因此，我們推測，葛根素可能會對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞Fas、Fas-L、Caspase-7表達產(chǎn)生影響。本實驗采用免疫印跡法檢測不同濃度的葛根素作用胰腺癌細(xì)胞48 h后Fas、Fas-L、Caspase-7的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著葛根素濃度的增加，F(xiàn)as、Fas-L、Caspase-7表達陽性率均明顯升高，實驗組和對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗表明，葛根素可能通過上調(diào)Fas、Fas-L蛋白表達，激活下游效應(yīng)因子Caspase-7，從而引起PANC-1細(xì)胞凋亡，但其對PANC-1細(xì)胞Fas/Fas-L信號通路上游分子的調(diào)節(jié)靶點與具體機制尚未完全明確，還需進一步研究。

Bcl-2蛋白家族屬于線粒體凋亡途徑的重要成員[13]，Bcl-2和Bax屬于Bcl-2蛋白家族。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放來參與細(xì)胞核內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運及膜通透性轉(zhuǎn)換,保持線粒體內(nèi)、從線粒體中釋放,進而抑制細(xì)胞凋亡。Bax是一種促凋亡蛋白，與Bcl-2的作用相反，對促進腫瘤細(xì)胞的凋亡具有重要作用。研究表明，Bcl-2可與Bax結(jié)合，組成異源二聚體，減弱Bax促凋亡作用而抑制凋亡，Bax/Bcl-2比值的升高會引起細(xì)胞線粒體膜電位的改變，從而促使細(xì)胞凋亡[14-16]。本研究表明，葛根素作用胰腺癌PANC-1細(xì)胞48 h后，隨著葛根素濃度的增加，Bax蛋白的表達量逐漸增加，Bcl-2蛋白的表達量逐漸下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，Bax和Bcl-2組成的異源二聚體減少，Bax/Bax同源二聚體增加，Bax/Bcl-2比值升高，從而促進PANC-1細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，葛根素能抑制PANC-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，并可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而發(fā)揮抗胰腺癌的作用。其機制可能與葛根素激活Fas/Fas-L信號通路，上調(diào)Fas、Fas-L、Caspase-7、Bax蛋白的表達，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達有關(guān)，但胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素影響過程，誘導(dǎo)凋亡的機制也是十分復(fù)雜的，仍需進一步研究。

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EffectsofpuerarinonproliferationandapoptosisofhumanpancreaticcancerPANC-1cells

LIU Yin-li1，WANG Ying2*

(1.Graduate School of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,China;2.Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of puerarin on human pancreatic cancer cell line PANC-1.MethodsPANC-1 cells of logarithmic growth phase were treated with different concentrations of puerarin (0,50,100 and 200 μmol/L) for 48 h;CCK-8 was used to detect the proliferation level of PANC-1 cells.Apoptosis was detected by Annexinv-FITC/PI double staining flow cytometry.Western blot was used to detect the expression of Fas,Fas-L,Bax,Bcl-2 and Caspase-7.ResultsPuerarin inhibited the proliferation of pancreatic cancer PANC-1 cells in a concentration-dependent manner.When different concentrations of puerarin interfered PANC-1 cells for 48 h,the apoptosis rate of cells respectively was 2.47%±0.64%,6.37%±0.71%,8.33%±0.90%,and 12.40%±1.01%,the difference between experimental group and control group being statistically significant (P<0.01).Western blot experiment showed that,after the 48 h intervention for PANC-1 of pancreatic cancer cell line,the expression of Fas,Fas-L,Caspase-7 and Bax protein increased with the increase of puerarin concentration,while the expression of Bcl-2 protein decreased,the difference between experimental group and control group being statistically significant (P<0.05).ConclusionPuerarin can induce PANC-1 cell proliferation inhibition；Apoptosis by activating Fas/Fas-L signaling pathway.

Puerarin;PANC-1 cell;Proliferation;Apoptosis;Fas/Fas-L

2017-04-02

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221002;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201711004