高效液相色譜法測定丙戊酸鎂血藥濃度的方法改進及質控評價

楊穎達，何秋月，李德秀，王天

（湖北省中西醫結合醫院藥學部，湖北 武漢 430000）

高效液相色譜法測定丙戊酸鎂血藥濃度的方法改進及質控評價

楊穎達，何秋月，李德秀，王天

（湖北省中西醫結合醫院藥學部，湖北 武漢 430000）

目的 改進測定人血清中丙戊酸鎂濃度的高效液相色譜法。方法 血清樣品經1.0 mol／L硫酸沉淀，以環己甲酸為內標，以2－溴 －4′－硝基苯乙酮為衍生試劑。采用高效液相色譜法測定，色譜柱為Hypersil C18柱（200 mm×4.6 mm，10 m），流動相為甲醇－水（81∶19），檢測波長為265 nm，流速為1.0 mL／min，柱溫為25℃。并對 2016年度醫院216份質控樣本進行統計分析。結果 內標和丙戊酸鎂衍生物的保留時間分別為 4.1 min 和 5.4 min，質量濃度線性范圍為 11.0 ～200.0 g／mL（r＝0.999 3），平均回收率為 98.2% ～102.5%，批內、批間精密度 RSD＜2.3%，穩定性試驗 RSD＜3.9%，2016年度質控數據批間 RSD＜15%，符合2015年版《中國藥典(四部)》要求。2016年度質控基本符合正態分布，所有質控數據均為在控。結論 改進后的方法簡便、快速、準確，適用于臨床丙戊酸鎂血藥濃度監測，室內質控評價保證了血藥濃度監測質量。

丙戊酸鎂；高效液相色譜法；血藥濃度監測；質控評價

丙戊酸鎂（magnesium valproate）是繼丙戊酸鈉后的臨床一線抗癲癇藥[1]。近年來，用于治療偏頭痛[2－3]、精神分裂癥攻擊行為[4－5]、腦卒中后抑郁[6]等，療效較好。由于該藥在使用過程中存在惡心、嘔吐、嗜睡、皮疹、水腫等不良反應[7－8]，合并用藥的慢性病患者較多[3，9]，有使用不當引起的中毒報告[10]。依據其療效和不良反應發生率與血藥濃度有一定的相關性[1]，定期動態監測其血藥濃度是其應用安全有效的保障。目前，已報道的質量濃度測定方法主要有色譜分析法，包括氣相色譜[11－12]和液相色譜[13－14]。本研究中在單位實驗室現有條件下，參考文獻[13]，改進并建立了測定患者血清丙戊酸鎂濃度的高效液相色譜（HPLC）法，并對2016年測定的質量控制進行了評價，準確性和穩定性較好，可為臨床合理用藥提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（Waters 2998光電二極管陣列檢測器，Empower 3工作站，美國Waters公司）；Discovery DV215CD型電子分析天平（美國奧豪斯公司）；XH－CX型漩渦混合器（金壇市白塔新寶儀器廠）；NW－10UV型超純水機（鄭州南北儀器設備有限公司）；SC－2556型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥

丙戊酸鎂標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 101151－201001）；環己甲酸（梯希愛＜上海＞化成工業發展有限公司）；2－溴－4′－硝基苯乙酮（上海弘順生物科技有限公司）；甲醇（美國天地有限公司），其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑上海有限公司）；空白血清（湖北省中西醫結合醫院檢驗科提供）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱（200 mm × 4.6 mm，10 μm）；流動相：甲醇 －水（81 ∶19）；檢測波長：265 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：25 ℃ ；進樣量：10 μL。定量分析：內標峰面積定量計算。

2.2 溶液制備

丙戊酸鎂標準品血清及質控血清：稱取丙戊酸鎂標準品11.0 mg，精密稱定，用甲醇定容至100 mL，配制成質量濃度為110.0 μg／mL的貯備液，精密吸取系列體積溶液，置5 mL離心管中，氮吹儀吹干甲醇，置4℃冰箱中貯存備用。待測定時向離心管中分別加入200 μL空白血清，制成系列質量濃度標準品血清及質控血清。

內標標準液：稱取環己甲酸5 mg，精密稱定，用正己烷定容至100 mL，配制成質量濃度為50 g／L的內標溶液。

衍生化試劑：稱取2－溴－4′－硝基苯乙酮5.0 mg，精密稱定，用乙腈定容至10 mL，配制質量濃度為0.5 g／L的溶液。

三乙胺乙腈液：精密吸取三乙胺0.2 mL，用乙腈稀釋至100 mL，即得。

以上所有配制溶液均置4℃冰箱保存備用。

2.3 血清樣品處理

取離心后的樣品血清 200 μL，加 1.0 mol／L 硫酸200 μL酸化，用500 μL環己甲酸正己烷內標液萃取離心，取上層有機相 200 μL，加三乙胺乙腈液 200 μL堿化，加衍生化試劑 50 μL，密置，50 ℃水浴 20 min，氮氣吹干，用100 μL甲醇溶解殘渣，取10 μL進樣測定。

2.4 方法學考察

分離度與專屬性試驗：按擬訂色譜條件測定，結果環己甲酸和丙戊酸鎂衍生物保留時間分別為4.1 min和 5.4 min，與血漿中的其他成分色譜峰分離度超過1.5，各成分基線分離良好，無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線和最低檢測限確定：取 11.0，22.0，44.0，66.0，132.0，200.0 μg ／mL 系列質量濃度丙戊酸鎂標準品血清，按2.3項下方法處理并測定，以丙戊酸鎂衍生物峰面積與內標衍生物峰面積之比(Y)為縱坐標，以標準品血清質量濃度(C，μg／mL)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.008 7 C ＋0.040 8， r＝0.999 3(n＝6)。結果表明，丙戊酸鎂質量濃度線性范圍為11.0 ～200.0 μg／mL，血清中最低檢測限為 11.0 μg／mL，最小定量限為 4 μg／mL（S ／N≥3）。

回收率及精密度試驗：取含丙戊酸鎂標準品低、中、高 3 個質量濃度（11.0，66.0，200.0 μg ／mL）的質控血清，按2.3項下方法處理，分別于1 d內和連續3 d內測定丙戊酸鎂濃度，計算批內及批間的回收率，批內及批間的精密度。結果見表1。

表1 回收率和精密度試驗結果(n＝5，%)

穩定性試驗：取含丙戊酸鎂標準品低、中、高3個質量濃度（11.0，66.0，200.0 μg ／mL）的質控血清各 2 mL，室溫放置，分別于0，4，21 h時測定丙戊酸鎂的質量濃度。另配上述質量濃度血清樣品各3份，每份2 mL，在4℃冰箱中放置，分別在2，4，7 d取樣，測定丙戊酸鎂的質量濃度。結果見表2，表明丙戊酸鎂血清樣品在室溫放置21 h內穩定，在4℃冷凍條件下放置7 d內穩定。

2.5 質控評價

2.5.1 回顧性質控圖分析

2016年1月至12月共測定質控樣本216份，其中低(11.0 μg ／mL)、中(66.0 μg ／mL)、高(200.0 μg ／mL)質量濃度質控樣本各72個。以各質量濃度質控樣本質量濃度（均值）為“靶值線”，即；以±2 s為“警告線”；以±3 s為“失控線”。以測定批次為橫坐標，以質量濃度為縱坐標，繪制質控圖，詳見圖2。結果低、中、高質量濃度質控數據基本分布在“靶值線”兩側，無數據超出±3 s“失控線”，故所有質控數據均為“在控”。但低質量濃度質控有2次超出±2 s，提示警告2次；中質量濃度質控有4次超出±2 s，提示警告4次；高質量濃度質控有2次超出±2 s，提示警告2次。3種質量濃度的質控樣本都出現了連續幾點落在“靶值線”下側，提示可能存在一定程度的系統誤差，可能與質控樣本的批次配制或新標準曲線的制作有關。

表2 樣品穩定性試驗結果(n＝3)

圖2 2016年質控數據分布圖

2.5.2 數據分布

圖3 各質量濃度質控數據分布比例圖

2.5.3 年度質控結果

將2016年1月至12月質控監測結果進行匯總統計，求得其平均值、標準差、回收率、RSD，詳見表3。結果表明，低、中、高3組質量濃度的實測值在標示值的±15%以內，批間 RSD小于15%，符合2015年版《中國藥典（四部）》中“9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則”，提示改進的方法測定丙戊酸鎂血藥濃度的長期穩定性和精密度均良好。

表3 2016年度質控結果

3 討論

3.1 色譜件選擇

本研究中丙戊酸鎂標準品血清及質控血清的配制可有效避免溶液保存引起的系統誤差，且無需復融質控血清，可簡化操作步驟。為除去樣品血清中蛋白質等雜質的干擾，要充分加入硫酸溶液，樣品血清與硫酸體積比最好為1∶1。參考文獻[13]，考察流動相條件時發現流動相為甲醇－水（75∶25）時環己甲酸和丙戊酸鎂衍生物保留時間分別為 5.8 min和 9.0 min，耗時較長；選擇甲醇－水（81∶19）時保留時間分別為4.1 min和5.4 min，分離度(R)＞ 1.5。提示內標和標準品均與血清中的其他組分色譜峰能很好地分離，檢測時間可由原來的10 min縮短至6 min，因而流動相選擇甲醇－水(81∶19)將色譜條件改進為后者。衍生化反應在50℃水浴必須保證反應20 min，反應充分完全，否則將影響檢測結果。文獻[13]中采用內標峰高法進行定量分析，由于峰高法受柱效、峰形、保留時間影響較大，而峰面積法受上述影響不大，因而本研究中采用內標峰面積法進行定量計算。

3.2 質控評價

本研究中所測定丙戊酸鎂血藥濃度的批內、批間及年度質控樣本的精密度和準確度均符合2015年版《中國藥典（四部）》“9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的規定。年度質控數據基本成正態分布，提示誤差來源主要為隨機誤差。盡管質控圖提示可能有一定的系統誤差存在，但所有質控數據仍在“在控”范圍內，因此本方法通過室內質控保證了血藥濃度監測質量。年度質控評價提示可能出現的系統誤差將密切關注，采取儀器校正、規范操作、內標對照等措施，及時糾正，以便為臨床提供快速、靈敏、準確、可靠的血藥濃度監測服務。

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Improvement of HPLC for Determination of Serum Concentration of Magnesium Valproate and Assesssment of Quality Control

Yang Yingda,He Qiuyue,Li Dexiu,Wang Tianqi
(Department of Pharmacy,Hubei Provincial Hospital of Itegrated Chinese＆ Western Medicine,Wuhan,Hubei,China 430000)

Objective To improve the HPLC method for determining the concentration of magnesium valproate in human serum.Methods The serum was precipitated by sulfuric acid(1.0 mol／L),the cyclohexane carboxylic acid was used as an internal standard and 2 －bromo － 4′－ nitroacetophenone was used as derivation agent.The HPLC method was used,the chromatographic column was C18column(200 mm × 4.6 mm,10 μm),the mobile phase was methanol－ water(81:19),the detection wavelength was 265 nm,the flow rate was 1.0 mL ／min,and the column temperature was 25 ℃ .Totally 216 quality control samples of the hospital in 2016 were statistically analyzed.Results The retention time of cyclohexanecarboxylic acid derivate and magnesium valproate derivative were 4.1 min and 5.4 min,respectively,the linearrange was 11.0 － 200.0 μg／mL(r＝ 0.999 3),and the average recovery was98.2% －102.5%,the RSDs of within batch and between batch were less than 2.3%,RSD of stability was less than 3.9%,RSD of quality control data in 2016 were less than 15%,which accorded with the requirement of Chinese Pharmacopoeia(2015 Edition,Volume Ⅳ).The quality controlbasically accorded with the normaldistribution in 2016,and allthe quality controldata were in control.Conclusion The improved method is simple,rapid and accurate,it is suitable for monitoring the concentration of magnesium valproate in serum,and the internal quality control ensures the monitoring quality of serum concentration.

magnesium valproate;HPLC;blood concentration monitoring;assesssment of quality control

R914.1；R971＋.6

A

1006－4931(2017)23－0010－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.003

武漢藥學會醫院藥學研究基金[武藥會201502003]。

楊穎達（1981－），女，博士研究生，主管藥師，研究方向為臨床藥學，(電子信箱)502099281＠qq.com。

王天 ，男，大學本科，主管藥師，研究方向為臨床藥學，（電子信箱）jeff200082＠163.com。

2017－07－19)