硼替佐米誘導間充質干細胞治療大鼠骨質疏松實驗研究

鄒敏君，劉銳鋒

（廣東省中山市人民醫院藥學部，廣東 中山 521403）

硼替佐米誘導間充質干細胞治療大鼠骨質疏松實驗研究

鄒敏君，劉銳鋒

（廣東省中山市人民醫院藥學部，廣東 中山 521403）

目的 探討硼替佐米誘導間充質干細胞分化治療大鼠骨質疏松的療效。方法 選取75只健康雌性大鼠，建立大鼠去卵巢骨質疏松模型，并隨機分為5組，測定5組大鼠的骨鈣素水平。再選取75只健康大鼠，獲取骨髓間充質干細胞，并按分組進行體外干細胞培養至形成集落。將形成的骨髓間質干細胞分別注入 1～5組大鼠的骨髓腔中，并分別給予 1～5組大鼠 0，0.1，0.3，0.5，1.5 mg／kg硼替佐米4周，每日抽取大鼠的外周血測定骨鈣素水平。4周后處死大鼠，取其長骨做切片，檢測大鼠的骨密度、骨髓間充質干細胞增殖指數和凋亡指數。結果 治療前，5組大鼠骨鈣素水平比較無明顯差異（P＞0.05），治療后，5組大鼠骨鈣素水平由高至低為1組、2組、3組、4組、5組；第5組大鼠的長骨骨密度和骨髓間充質干細胞增殖指數均高于其他4組大鼠（P＜0.05），凋亡指數低于其他4組大鼠（P＜0.05）。結論 硼替佐米誘導間充質干細胞治療大鼠去卵巢骨質疏松效果確切，在絕經后骨質疏松患者的臨床治療中應用可行。

硼替佐米；間充質干細胞；骨質疏松；增殖指數；凋亡指數；骨鈣素水平；骨密度

骨質疏松（osteoporosis，OP）是由多種原因導致的骨密度下降、骨脆性增加的疾病，發病群體以絕經后婦女為主，隨著病程的延長，患者丟失骨量不斷增多，發生全身性骨病的風險也會不斷增加[1－3]。但目前的治療辦法主要集中于維持治療，用藥時間長且藥物具有一定毒性，因此臨床需要積極治療手段。骨髓間充質干細胞是一種多向分化的干細胞，能有效分化成骨骼細胞、脂肪、肌肉細胞，當其分化為骨骼細胞后可有效并安全地治療骨質疏松[4]。目前，使用骨髓間充質干細胞治療骨質疏松遇到的一個棘手問題是間充質干細胞分化的無序性，如何能成功促使間充質干細胞向成骨細胞分化，是改善干細胞治療臨床療效的主要方向[5]。近年來的研究發現，通過藥物靶向作用于干細胞促進干細胞定向分化，可有效提高骨質疏松患者的臨床治療有效率[6]。使用蛋白質抑制劑硼替佐米能影響多發性骨髓瘤患者成骨細胞分化[7]。本研究中探討了硼替佐米誘導間充質干細胞聯合治療大鼠骨質疏松的療效，旨在為臨床制訂骨質疏松的有效治療方案提供參考。為避免大劑量硼替佐米導致骨髓間充質干細胞加速凋亡[8]，本試驗選用小劑量硼替佐米梯量上升給藥方案。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：150只 SPF級健康 SD大鼠（許可證號為SCXK2012－0001），雌性，8～10周齡，體質量 229～262g，平均（242.1 ± 3.6）g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，由實驗動物質量檢測中心質檢合格，且均符合試驗要求。其中75只大鼠用于制作大鼠去卵巢骨質疏松模型[9]，另外75只大鼠用于獲取骨髓間充質干細胞。

儀器：EK－8800 C型全數字彩色超聲波骨密度儀（北京澤澳醫療科技有限公司，誤差不超過±1.5%）；HF－220型全自動生化儀（泰安市康宇醫療器械有限公司）；PinAAcle 900型原子吸收光譜（珀金埃爾默企業管理＜上海＞有限公司）；CHK－2561AB型紫外分光光度計（北京昌科儀自動化科技有限公司）；BN 0100型電子分析天平（溫州百恩儀器有限公司，最小分度值0.01～0.000 1）；WS70型紅外線干燥箱（上海高致精密儀器有限公司）；HH－4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市友聯儀器研究所）。

試藥：硼替佐米(商品名萬珂，西安楊森制藥有限公司，國藥準字 J20050042，規格為每瓶3.5 mg)；葡萄糖酸鈣注射液（濟南利民制藥有限責任公司，國藥準字H37021227，規格為每支 10 mL ∶1 g）；維生素 C 片（浙江瑞新藥業股份有限公司，國藥準字H33021139，規格為每片0.1 g）；酒石酸銻鉀（武漢遠成共創科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠去卵巢骨質疏松模型制備

取75只大鼠用于制作大鼠去卵巢骨質疏松模型，隨機分為 1，2，3，4，5 組，各 15 只。根據大鼠體質量進行腹腔內麻醉→備毛→手術（暴露腹腔，沿著子宮下角找到卵巢并摘除）→術后護理（為防止感染，每天注射20萬U的青霉素）。取另外75只健康雌性大鼠的骨髓間充質細胞，進行體外培養。5組大鼠均自由進食、飲水，5組大鼠從術后第7天算起，灌胃至3個月，末次給藥后24 h，麻醉大鼠，股動脈收集血液采集標本進行各項試驗。

1.2.2 大鼠骨質疏松治療及指標檢測方法

將培養至形成集落的骨髓間充質干細胞注入到1～5組大鼠的骨髓腔內，并分別給予1～5組大鼠0，0.1，0.3，0.5，1.5 mg／kg 硼替佐米，腹腔注射給藥，連續給藥4周。實施治療前后分別采集5組大鼠外周血，測定骨鈣素水平，計算平均值。4周后處死5組大鼠，取長骨做切片，檢測骨密度及骨髓間充質干細胞增殖指數和凋亡指數，并對比治療前后的骨鈣素水平[10－11]。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件分析。計量資料采用均數 ±標準差（±s）表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨鈣素水平

治療前，5組大鼠的骨鈣素水平無統計學差異（P＞0.05）；使用硼替佐米后，4組大鼠的骨鈣素水平均降低，與治療前比較存在明顯差異（P＜0.05），第5組大鼠的骨鈣素水平明顯低于其他組。詳見表1。

表1 5組大鼠骨鈣素水平比較（± s， g／L，n＝15）

表1 5組大鼠骨鈣素水平比較（± s， g／L，n＝15）

注：與其他 4 組比較， P ＜0.05。下表同。

組別1組2組3組4組5組治療前1.1 8 ± 0.0 5 1.1 9 ± 0.0 5 1.1 7 ± 0.0 4 1.1 8 ± 0.0 6 1.1 5 ± 0.0 3治療后1.1 4 ± 0.0 4 1.0 8 ± 0.0 4 0.9 8 ± 0.0 5 0.7 6 ± 0.0 6 0.4 9 ± 0.0 9 t值9.8 3 2 1 0.3 3 4 1 0.3 4 7 1 0.6 5 4 1 1.3 4 2 P值0.0 3 3 0.0 2 1 0.0 2 4 0.0 1 8 0.0 0 5

2.2 骨密度

治療后，第5組大鼠的骨密度明顯高于其他組（t＝11.230,P ＝0.21），其中 1組大鼠最低。詳見表 2。

表2 5組大鼠骨密度比較（± s，g／cm2，n＝15）

表2 5組大鼠骨密度比較（± s，g／cm2，n＝15）

組別1組2組3組4組5組t值P值骨密度0.1 3 ± 0.0 7 0.1 7 ± 0.0 9 0.2 5 ± 0.0 8 0.3 2 ± 0.0 6 0.4 1 ± 0.0 8 1 1.2 3 0 0.0 2 1

2.3 骨髓間充質干細胞增殖指數、凋亡指數

經檢測發現，第5組大鼠的干細胞增殖指數高于其他4組大鼠（P＜0.05），凋亡指數明顯低于其他4組大鼠（P ＜0.05）。詳見表 3。

3 討論

女性絕經后5年內的丟失骨量為1.5% ～2.5%，絕經后10年，每年丟失骨量可達5%，因此25% ～50%的60歲以上老年女性患有骨質疏松[12]。女性絕經后易發生骨質疏松的原因為，女性進入更年期后，卵巢開始萎縮，體內雌激素分泌水平急劇降低，導致骨代謝出現明顯的負平衡，新生的骨組織開始減少[13]，丟失的骨質開始增多，最終對骨組織結構產生影響，使骨脆性增加，引起疼痛，增加患者發生骨折的風險[14]。絕經后骨質疏松的發生不僅嚴重危害患者的身體健康，影響患者生活質量，還會增加國家及家庭財力與人力負擔。現階段，我國臨床治療該疾病的主要手段為激素和阿倫磷酸鈉等藥物維持治療，尚無積極有效的治療手段。

表3 5組大鼠的骨髓間充質干細胞增殖指數、凋亡指數比較（± s，%，n＝15）

表3 5組大鼠的骨髓間充質干細胞增殖指數、凋亡指數比較（± s，%，n＝15）

組別1組2組3組4組5組t值P值增殖指數2 7.3 6 ± 4.2 9 3 5.2 4 ± 5.2 2 4 2.1 1 ± 5.1 3 4 9.1 6 ± 4.9 8 5 6.3 0 ± 5.0 2 1 1.4 4 5 0.0 1 7凋亡指數4.2 1 ± 0.0 9 3.5 4 ± 0.2 9 3.0 6 ± 0.3 1 2.7 1 ± 0.3 3 2.2 1 ± 0.3 4 1 1.3 3 2 0.0 1 9

1996年，骨髓間充質干細胞為Friedenstein所發現。間充質干細胞是一種能夠多向分化的干細胞[15]，能有效分化成骨骼細胞，脂肪，肌肉細胞，因此發現后被移植領域作為研究熱點，采用干細胞分化成為骨骼細胞，具有安全、低毒、取材方便等優勢。硼替佐米是哺乳動物細胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑。26S蛋白酶體是一種大的蛋白質復合體，具有降解蛋白和維持細胞內環境穩定的作用。基于骨髓間充質干細胞和硼替佐米所具有的作用機制，該藥物通過作用于Runx－2受體來抑制骨髓間充質干細胞向破骨細胞分化，從而提高間充質細胞治療骨質疏松的成功率[16－17]。

本研究結果顯示，治療后硼替佐米用藥劑量最大的第5組大鼠的骨鈣素水平明顯低于其他4組大鼠，骨密度明顯高于其他4組大鼠，同時在使用該劑量硼替佐米所誘導的骨髓間充質干細胞增殖指數較其他4組大鼠高，凋亡指數較其他4組大鼠低。表明骨髓間充質干細胞聯合硼替佐米治療骨質疏松大鼠療效確切，且與硼替佐米的用藥劑量呈正相關。由于本次研究為動物試驗研究，因此所得結果的客觀性仍需通過大量臨床研究進行驗證。

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Experimental Study of Mesenchymal Stem Cells Induced by Bortezomib in the Treatment of Osteoporosis in Rats

Zou Minjun,Liu Ruifeng
(Department of Pharmacy,Zhongshan People′s Hospital,Zhongshan,Guangdong,China 521403)

Objective To investigate the clinical effect of mesenchymal stem cells induced by bortezomib in the treatment of osteoporosis in rats.Methods Totally 75 healthy female rats were selected to establish the ovariectomized osteoporosis model of rats and randomly divided into 5 groups.The osteocalcin levels of the 5 groups were measured.Another 75 healthy experimental rats were selected to obtain bone marrow mesenchymal stem cells,which were cultured in vitro until form a colony.The bone marrow mesenchymal stem cells were injected into the bone marrow cavity of the rats in the 5 groups,rats in group 1 － 5 were given 0,0.1,0.3,0.5,1.5 mg ／kg bortezomib for 4 weeks,the peripheral blood of rats was extracted daily and osteocalcin levels were measured.After 4 weeks,the rats were killed,and the long bones of the rats were taken for sections,the bone mineral density,proliferation index and apoptosis index of bone marrow mesenchymal stem cells were measured.Results There was no significant difference in osteocalcin levels between the 5 groups before treatment(P ＞ 0.05),after treatment,the osteocalcin levels of the 5 groups were from high to low as follows:group 1,group 2,group 3,group 4,group 5.The bone density of the long bone and the proliferation indexes of bone and marrow mesenchymal stem cells in group 5 were significantly higher than those in the other 4 groups(P ＜ 0.05),and the apoptotic index in group 5 was lower than those in the other 4 groups(P ＜ 0.05).Conclusion Mesenchymal stem cells induced by bortezomib is effective in the treatment of ovariectomized osteoporosis in rats,and it is feasible in the clinical treatment of postmenopausal osteoporosis.

bortezomib;mesenchymal stem cell;osteoporosis;proliferation index;apoptosis index;osteocalcin level;bone density

R965.2；R979.1

A

1006－4931(2017)23－0014－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.004

鄒敏君（1982－），女，碩士研究生，主管藥師，研究方向為醫院藥學，（電子信箱）25194130＠qq.com。

2017－08－29；

2017－10－12)