固相萃取－反相高效液相色譜法檢測木瓜丸中雙酯型生物堿限度

鞏曉宇 ，陸燕萍，陳喜悅，邱鳳鄒 ，陳秋燕

（1.廣東省深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518172； 2.廣東省深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518120）

固相萃取－反相高效液相色譜法檢測木瓜丸中雙酯型生物堿限度

鞏曉宇1，陸燕萍1，陳喜悅2，邱鳳鄒1，陳秋燕1

（1.廣東省深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518172； 2.廣東省深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518120）

目的 建立同時測定木瓜丸中3種雙酯型生物堿含量的固相萃取－反相高效液相色譜（SPE－HPLC）法。方法 色譜柱采用Eclipse XDB － C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 m），流動相為 0.1%醋酸銨溶液(冰醋酸調(diào) pH ＝3.5)－ 乙腈(75∶25)，流速為 1.0 mL ／min，檢測波長為235 nm，柱溫為 40 ℃。結(jié)果 新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿質(zhì)量濃度分別在 1.25 ～ 12.5 g／mL，3.10 ～31.0 g／mL，3.24 ～32.4 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；平均加樣回收率為98.01%，RSD為1.50(n＝6)。結(jié)論 該方法快速簡便，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，可用于木瓜丸中3種有毒雙酯型生物堿含量測定，以控制藥品質(zhì)量。

木瓜丸；雙酯型生物堿；固相萃取；高效液相色譜法

木瓜丸為國家基本藥物目錄品種，具有祛風(fēng)散寒、除濕通絡(luò)、活絡(luò)止痛的功效,主治寒濕閉阻所致的痹病，癥見關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、屈伸不利、局部畏惡風(fēng)寒、肢體麻木、腰膝酸軟。其由木瓜、當(dāng)歸、川芎、白芷、威靈仙、狗脊、牛膝、雞血藤、海風(fēng)藤、人參、制川烏、制草烏組方，方中制川烏、制草烏是主要有效成分，其中含新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿等有毒成分。在現(xiàn)有藥材標(biāo)準(zhǔn)中，有針對這3種雙酯型生物堿的限度檢測[1]。為了保障臨床用藥安全，有必要制訂該復(fù)方中這3種雙酯型生物堿的檢測方法。復(fù)方制劑中3種生物堿的含量比較低，目前對復(fù)方制劑中雙酯型生物堿的檢測主要采用毛細(xì)管電泳法、超高效液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜連用法等，關(guān)于木瓜丸含量測定的高效液相色譜檢測方法有很多[2－4]，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的樣品處理方法，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，影響分析結(jié)果。本研究中采用固相萃取處理樣品[5－6]，可去除樣品中大部分干擾雜質(zhì)，以達(dá)到凈化樣品的目的，提高含量分析的準(zhǔn)確性，起到有效控制藥品質(zhì)量的作用，為進(jìn)一步完善該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，包含真空在線脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器和化學(xué)工作站；AB204－N型電子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司）；650Y型超聲波提取儀（上海比朗儀器制造公司）；Milli－Q型超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；固相萃取柱(迪馬Pro Elut PSA，正相硅膠鍵合)。

1.2 試藥

新烏頭堿對照品（批號為110799－200404），烏頭堿對照品（批號為110720－200410），次烏頭堿對照品（批號為110798－200404），均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；木瓜丸[江西藥都樟樹制藥有限公司，批號分別為 150206，150306，150401；葵花藥業(yè)集團(tuán)＜佳木斯＞有限公司(A公司),批號為201504013；廣州白云山光華制藥股份有限公司，批號為T40088；華潤三九＜南昌＞藥業(yè)有限公司，批號為1501077J；湖北廣仁藥業(yè)有限公司，批號分別為 150912，150909，151121；北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司（B公司)，批號為20150413；武漢太福制藥有限公司（C公司)，批號分別為 T140031，T150188]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Eclipse XDB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1% 醋酸鈉溶液（冰醋酸調(diào) pH 至3.5） －乙腈（75∶25）；流速：1.0mL ／min；檢測波長：235nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品溶液：分別取烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品 6.1，15.5，16.2 mg，，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加異丙醇－三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容，得混合對照品貯備液。精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加異丙醇－三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品，粉碎，過三號篩，稱取0.5 g，精密稱定，加25 mL甲醇混勻，超聲處理30 min，過濾，濾液經(jīng)固相萃取小柱（使用前先活化：取甲醇和純化水適量，交替淋洗），用25 mL甲醇沖洗固相萃取小柱，收集流出液，甲醇定容，置50 mL容量瓶中，即得。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：按擬訂色譜條件，取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果3種雙酯型生物堿色譜峰面積的 RSD 分別為 1.6% ，0.8% ，1.1%(n ＝ 5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批(批號為150912)的樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的 RSD分別為0.6%，0.9%，0.5%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

線性關(guān)系考察：精密量取混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，用異丙醇 －三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容至刻度，按擬訂色譜條件進(jìn)樣檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的回歸方程分別為 Y＝3.22×104X＋152.9（r＝ 0.999 2）， Y＝ 6.17 × 104X ＋ 93.7（r＝ 0.999 6），Y＝1.42×104X ＋245.1（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，新烏頭堿質(zhì)量濃度在 1.25 ～ 12.5 μg／mL，烏頭堿質(zhì)量濃度 在 3.10 ～ 31.0 μg／mL， 次 烏 頭 堿 質(zhì) 量 濃 度 在3.24～32.4 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品(批號為150912)溶液，分別于 0，1，4，8，24，48 h 時進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的 RSD分別為 2.1% ，1.9% ，1.7%(n ＝ 6)，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為150912），精密量取0.5 g，共6份，置錐形瓶中，分別加入對照品溶液0.1 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并測定，以新烏頭堿計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 新烏頭堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.4 樣品含量測定

取不同批次樣品，依法制備供試品溶液，按外標(biāo)法測定含量。結(jié)果見表2。

表2 各批樣品中雙酯型生物堿的測定結(jié)果(n＝6， g／g)

3 討論

3.1 樣品處理方法選擇

選擇固相萃取[7－10]進(jìn)行樣品處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固相萃取法能較好地提純樣品，雜質(zhì)較少，相對于回流提取、萃取法，可更好地改善色譜圖質(zhì)量，提高分析的精密度和準(zhǔn)確性。選擇固相萃取方法，也考察過流出曲線圖。以甲醇沖洗，每5 mL收集1份樣品，分別進(jìn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗出液達(dá)到20 mL時，樣品已基本洗脫完全，故供試品溶液中選擇用25 mL甲醇洗脫基本能完全達(dá)到洗出的要求。

3.2 雙酯型生物堿限度檢測

木瓜丸中雖然投料制川烏、制草烏，但相對于飲片而言，其中雙酯型生物堿含量極低，大部分樣品中3種雙酯型生物堿含量低于定量限，甚至低于檢測限，建議限度標(biāo)準(zhǔn)采用峰面積總和與對照品總峰面積進(jìn)行比對。

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Determination of Diester Alkaloid Limit in Mugua Pills by SPE－HPLC

Gong Xiaoyu1,Lu Yanping1,Chen Xiyue2,Qiu Fengzou1,Chen Qiuyan1
(1.People′s Hospital of Longgang District,Shenzhen,Guangdong,China 518172; 2.Maternity and Child Healthcare Hospital of Shenzhen Dapeng New District,Shenzhen,Guangdong,China 518120)

Objective To establish an SEP－HPLC method for simultaneous determination of three kinds of diester alkaloids in Mugua Pills.M ethods The Eclipse XDB － C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted,the mobile phase was 0.1% ammonium acetate solution(pH was adjusted to 3.5 by glacial acetic acid) － acetonitrile(75 ∶25),the flow rate was 1.0 mL ／min,the detection wavelength was 235 nm,and the column temperature was 40 ℃.Results The concentrations of new aconitine,aconitine and hypaconitine were in the range of 1.25 － 12.5 μg ／mL,3.10 － 31.0 μg ／mL,3.24 － 32.4 μg ／mL,the average recovery was 98.01% and RSD was 1.50%(n ＝ 6).Conclusion The method is rapid,simple,accurate,reliable and sensitive.It can be used to determine the contents of three toxic diester alkaloids in Mugua Pills and to control the quality of the drugs.

Mugua Pill;diester alkaloids;solid phase extraction;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)23－0017－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.005

廣東省深圳市龍崗區(qū)科技發(fā)展資金醫(yī)療衛(wèi)生（扶持類）項(xiàng)目[YLWS20150514153303078]。

鞏曉宇(1983－)，女，碩士研究生，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定，（電子信箱）xiaoyu123126＠163.com。

2017－06－06)