高效液相色譜法測定銀蜜片中麥角甾醇含量

許 莉，趙小勤，文永盛 ，周世玉

（四川省成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045）

高效液相色譜法測定銀蜜片中麥角甾醇含量

許 莉，趙小勤，文永盛 ，周世玉

（四川省成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045）

目的 建立測定銀蜜片中麥角甾醇含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱采用Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流動相為甲醇 －水（93∶7），流速為 1.0 mL／min，檢測波長為 283 nm，柱溫為 35℃。結(jié)果 麥角甾醇進樣量在 0.09～1.02 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y＝1 508.708 1 X＋26.629 2（r＝0.999 8），平均加樣回收率為 97.50% ，RSD 為 2.05%(n＝9)。結(jié)論 該法簡便、準確、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為銀蜜片的質(zhì)量控制方法。

銀蜜片；麥角甾醇；含量測定

銀蜜片選用具有扶正固本作用的銀耳耳基粉和有活血功能的天麻蜜環(huán)菌粉配制而成，可增加冠狀動脈血流量，降低冠脈阻力，改善心肌缺血，還具有止咳化痰、鎮(zhèn)靜安眠、提高機體免疫力的功效，用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)、慢性支氣管炎、神經(jīng)衰弱等癥[1－3]。銀蜜片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準[4]中僅有理化鑒別，無含量測定項，專屬性和質(zhì)量可控性差。麥角甾醇廣泛存在于藥用真菌子實體和發(fā)酵菌絲中，是真菌細胞膜的重要組分，也是真菌類的特征化合物。以麥角甾醇為代表的甾醇類成分具有抗腫瘤、抗炎、促進免疫、抗菌、降低膽固醇等多種藥理作用[5－10]。為保證臨床用藥效果，更好地控制銀蜜片的質(zhì)量，本研究中建立了測定銀蜜片中麥角甾醇含量的高效液相色譜法，為其質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Waters－e 2695型高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司）；AE240型電子天平(德國賽多利斯公司）；AUX220型電子天平(日本島津公司）；HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司）；SK250H型超聲波清洗機器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）等。

1.2 試藥

麥角甾醇對照品（批號為111845－201102，含量為97.7%，供含量測定用）由中國食品藥品檢定研究院提供；銀密片(山西康欣藥業(yè)有限公司，批號分別為150502，151001，151201)；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：AgilentEclipse plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水（93 ∶7）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：283 nm；柱溫：35℃。理論板數(shù)按麥角甾醇峰計算應(yīng)不低于3 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

稱取麥角甾醇對照品 17.45 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.170 5 g／L的對照品貯備液。取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細，取1.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入70%甲醇100 mL，索氏回流提取4 h，提取液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對照品貯備液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液Ⅰ，質(zhì)量濃度為0.017 05 g／L；精密量取對照品濃溶液3.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液Ⅱ，質(zhì)量濃度為0.051 15 g／L。精密吸取對照品溶液Ⅰ5，10，15，20 μL 和對照品溶液Ⅱ10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，依法測定。以進樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，得回歸方程 Y＝1 508.708 1 X＋26.629 2（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，麥角甾醇進樣量在 0.09 ～ 1.02 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取麥角甾醇對照品溶液（0.017 05 g／L）20 μL，重復(fù)進樣 6 次。結(jié)果峰面積的RSD為1.46%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一（批號為150502）供試品溶液，分別于 0，2，4，8，16，24 h 時注入高效液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.74%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為150502）樣品1.5 g，精密稱定，共稱取6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，測定峰面積結(jié)果，計算含量。麥角甾醇平均含量為0.074 mg／g，RSD 為 0.85%(n ＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的供試品（批號為150502）0.75 g，精密稱定，共稱取 9 份，分別精密加入一定量的對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.170 5 g／L），按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 麥角甾醇加樣回收試驗結(jié)果(n＝9)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，計算含量。結(jié)果批號為150502，151001，151201的 3批樣品中麥角甾醇含量分別為0.020，0.019，0.014 mg ／g。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

采用紫外－可見分光光度儀對麥角甾醇的甲醇溶液在200～400 nm波長范圍進行掃描，結(jié)果 λmax為283 nm，確定283 nm作為本試驗的檢測波長。考察了甲醇－水（91 ∶9）、甲醇 － 水（93 ∶7）、甲醇 － 水（95 ∶5），乙腈 － 水（95∶5）等體系下的麥角甾醇對照品峰形及樣品中麥角甾醇與其他成分的分離情況。結(jié)果表明，甲醇－水（93∶7）流動相條件下，麥角甾醇峰形窄、對稱，能與樣品中其他成分分離，且試驗操作簡便。故確定甲醇－水（93∶7）為流動相。在擬訂色譜條件下，比較了不同色譜柱[Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，Dikma C18柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm)，Sepax GP －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)]、不同儀器[Agilent 1200 型高效液相色譜儀、Agilent 1260型高效液相色譜儀、Waters－e2695型高效液相色譜儀]，麥角甾醇色譜峰均可達到基線分離，峰形對稱，理論板數(shù)均在10 000以上，系統(tǒng)適用性良好。采用高效液相色譜法測定銀蜜片中麥角甾醇的含量，經(jīng)過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率試驗考察，結(jié)果均符合要求。

3.2 提取方法考察

考察提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇）、提取方法（回流、超聲、索氏提取）、提取時間（3，4，5，6 h），最終確定最佳提取條件為70%甲醇索氏回流提取4 h。

3.3 結(jié)果分析

本試驗中測定了3批銀蜜片中麥角甾醇的含量，結(jié)果顯示，不同批次銀蜜片中麥角甾醇的含量差異較大，含量范圍為 0.014 ～0.020 mg／g，平均值為 0.018 mg／g。以上數(shù)據(jù)可為增加銀蜜片中麥角甾醇含量限度提供參考依據(jù)。

[1]林伯香，鄭儀信.銀蜜片鑒定會在福建三明召開[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1984，4（4）:36.

[2]鄭義信.新藥銀蜜片通過技術(shù)鑒定[J].中國藥學(xué)雜志，1983，18（5）:21.

[3]周臨深，曹清漪，王淑云，等.銀蜜片治療冠心病102例臨床療效分析[J].北京中醫(yī)，1982，1(3):24 －26.

[4]WS3－B－1834－94，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準·中藥成方制劑(第九冊)[S].

[5]鄧玉清，王 紀，虞 龍.微生物麥角甾醇的研究進展[J].微生物學(xué)雜志，2001，21(3):45 －47.

[6]蔡鵬麗，何秀萍，劉 楠，等.甾醇C－22去飽和酶高表達對酵母細胞麥角甾醇合成的影響[J].微生物學(xué)報，2007，47(2):274－279.

[7]Reeslev M，Miller M，Nielsen KF.Quantifying mold biomass on gypsum board:comparison of ergosterol and beta－N－acetylhexosaminidase as mold biomass parameters[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69(7):3996 － 3998.

[8]Hirasawa M，Shouji N，Neta T，et al.Three kinds of antibacterial substances from Lentinus edodes(Berk.)Sing.(Shiitake，an edible mushroom)[J].International Journal of Antimicrobial Agents，1999，11(2):151 － 157.

[9]南春輝.麥角甾醇的研究進展[J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2009(10):6－7.

[10]曹龍輝，李曉 ，趙文紅，等.麥角甾醇的研究進展[J].中國釀造，2014，33(4):9－12.

Content Determination of Ergosterol in Yinmi Tablets by HPLC

Xu Li,Zhao Xiaoqin,Wen Yongsheng,Zhou Shiyu
(Chengdu Institute for Food and Drug Control,Chengdu，Sichuan,China 610045)

Objective To establish an HPLC method for content determination of ergosterol in Yinmi Tablets.Methods The chromatographic column was Agilent Eclipse plus C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)with methanol－ water(93 ∶7)as the mobile phase,the flow rate was 1.0 mL ／min,the detection wavelength was 283 nm and the column temperature was 35 ℃ .Results The linearity of ergosterol were good in the range of 0.09 －1.02 μg and the regression equation was Y＝1 508.708 1X ＋26.629 2(r＝0.999 8).The average recovery was 97.50%,and the RSD was 2.05%(n ＝ 9).Conclusion This method is simple,accurate,well sensitivity and reproducible,which can be used for the quality control of Yinmi Tablets.

Yinmi Tablets;ergosterol;content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)23－0026－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.008

許莉，女，主管中藥師，研究方向為中藥質(zhì)量標(biāo)準，（電子信箱）xulicd1987＠sina.com。

文永盛，男，副主任中藥師，研究方向為中藥質(zhì)量標(biāo)準，（電子信箱）cdwyscd＠163.com。

2017－08－16)