米湯發酵乳乳酸菌的篩選及其制備工藝

陳大衛，楊壯壯，黃玉軍，瓦云超，張玉律，杜楊洋，李春雨

（揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室食品科學與工程學院，江蘇揚州 225009）

米湯發酵乳乳酸菌的篩選及其制備工藝

陳大衛，楊壯壯，黃玉軍，瓦云超，張玉律，杜楊洋，李春雨

（揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室食品科學與工程學院，江蘇揚州 225009）

從貴州酸湯樣品中分離篩選乳酸菌，并研究米湯的添加量、發酵時間、白砂糖添加量等工藝條件對米湯發酵乳感官特性的影響，最終確定米湯發酵乳的最佳工藝配方。結果表明，適合米湯發酵乳發酵的菌株為M-14-3-3和P-3-3-7；當米湯添加量20%，白砂糖添加量8%，兩菌株的混合比例1∶1，并以4%的接種量，于37℃下發酵15 h時，米湯發酵乳的口感細膩、酸甜適口，具有米湯特有的清香，其酸度為94.8°T，黏度為1 236 cP，活菌數為1.5×108CFU/mL，理化及微生物指標均符合風味發酵乳產品標準；15 d內具有較好的貯藏特性，乳酸菌活菌數7.5×107CFU/mL，酸度117.3°T，黏度1670 cP。

米湯；發酵乳；制備工藝

米湯性味甘平，具有益氣、養陰、潤燥的功能，除含有大量的煙酸、VB1，VB2，以及磷、鐵等無機鹽外，還含有較多的碳水化合物和脂肪等營養元素；同時含有的人體必需脂肪酸含量也高于其他食物，經常喝米湯有助于消化和對脂肪的吸收；米湯中還含有豐富的色氨酸，能夠促使大腦神經細胞分泌出一種催人欲睡的“血清素”，有助于睡眠[1]。

乳酸菌作為人體腸道中的重要益生菌，具有調節腸道菌群結構、改善胃腸道功能、增強機體的抗氧化能力和免疫力等功能[2]，被廣泛應用于食品發酵。益生乳酸菌發酵米湯的一個重要功能就是具有更完善的營養功能，包括人體必需的糖分、脂肪和蛋白質，同時維生素含量更為豐富，含有18種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，且每種氨基酸比非發酵米湯含量高，能夠更好地發揮抗疲勞和增強機體對外界應激能力的作用。米湯發酵乳還含有多種微量元素，尤其鈣、鋅、鐵、銅含量較豐富，鈣能維持人體骨骼和牙齒的健康，具有安定情緒的作用；鋅能促進生長發育，增強創傷組織的再生能力，加速組織愈合，增強機體免疫功能；鐵是構成血紅蛋白的主要成分之一，缺鐵可引起缺鐵性貧血。因此，隨著生活水平的不斷提高及自我保健意識的增強，米湯發酵乳越來越受到消費者的歡迎。

貴州“米酸湯”“紅酸湯”中的乳酸菌含量較高，且適合于米湯的發酵[3-4]。因此，從中篩選乳酸菌，并以品質較好的糙米為米湯原料，探討發酵過程中的接菌方式、米湯添加量、發酵時間等發酵條件對米湯發酵乳風味的影響，進而確定米湯發酵乳的最適發酵工藝條件，為米湯發酵乳的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

米酸湯、紅酸湯，貴州農家制備；全脂乳粉，新西蘭恒天然公司提供；氫氧化鈉、鹽酸、胰胨、魚粉蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、半胱氨酸、吐溫-80、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、酚酞，國藥集團化學試劑有限公司提供，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

JF-SX-500型全自動滅菌鍋，日本TOMY公司產品；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；培養箱，上海新苗醫療器械有限公司產品；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產品；黏度測定儀（RVD-VII+），Brook Field Engineering Laboratories產品；GYB60-6S型高壓均質機，上海東華高壓均質機廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化及鑒定

將貴州“米酸湯”“紅酸湯”樣品經梯度稀釋后，采用MRS固體培養基分離樣品中的乳酸菌[5]，于37℃下培養48 h，挑取平板上的疑似乳酸菌菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，并進行接觸酶、KOH、吲哚、運動性等生理生化試驗[6]。將純化后的乳酸菌于MRS液體培養基中于37℃下培養24 h，置于4℃冰箱中貯藏備用或凍干保藏。

1.2.2 乳酸菌的篩選

將活化后的乳酸菌按3%接種量接種至全脂乳培養基中于37℃下培養，參照GB 5009.239—2016[7]的方法分別在0，2，4，6，8，10 h時測定發酵乳的酸度，采用黏度計測定其黏度值。

1.2.3 米湯發酵乳發酵條件的研究

用粉碎機將糙米粉碎（粗粉） 得到米粉，經過100目篩篩選得到精細米粉，混以一定量水經煮沸得到米糊，再過濾取湯則獲得原味米湯。將米湯添加到牛乳中發酵。發酵后于4℃下冷藏，之后對發酵乳進行品嘗打分。

發酵乳感官評分標準見表1。

表1 發酵乳感官評分標準

（1）接菌方式。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質后殺菌、冷卻；將篩選獲得的菌種分別以單一菌株及兩者比例分別以1∶1，2∶1，1∶2的方式接種后，在41℃條件下發酵16 h，根據表1評定接菌方式對產品感官特性的影響（試驗中百分比均以牛奶用量為基準）。

（2） 米湯添加量。將分別含有10%，15%，20%，25%，30%米湯，9%白砂糖的牛乳均質后殺菌、冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發酵，在41℃條件下發酵16 h，依據表1評定不同米湯添加量對產品感官特性的影響。

（3）發酵時間。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質后殺菌、冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發酵，于41℃條件下分別發酵10，12，14，16，18 h，依據表1評定不同發酵時間對產品感官特性的影響。

（4）發酵溫度。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質后殺菌、冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發酵，分別在29，33，37，41，于45℃條件下發酵14 h，依據表1評定不同發酵溫度對產品感官特性的影響。

（5） 白砂糖添加量。將含有20%米湯及分別含有7%，8%，9%，10%，11%白砂糖的牛乳均質后殺菌，冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發酵，于37℃條件下發酵14 h，依據表1評定不同白砂糖添加量對產品感官特性的影響。

（6）乳酸菌接種量。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質后殺菌、冷卻；將篩選獲得的乳酸菌分別以以2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%的接種量接種發酵，于37℃條件下發酵14 h，依據表1評定不同乳酸菌接種量對產品感官特性的影響。

（7）正交設計優化試驗。在單因素試驗結果的基礎上，選擇米湯添加量、白砂糖添加量、發酵時間及發酵溫度作為4個因素，各取3個水平，以感官評價作為指標，設計正交試驗表，進行米湯發酵乳發酵工藝的優化。

米湯發酵乳工藝因素與水平設計見表2。

表2 米湯發酵乳工藝因素與水平設計

1.2.4 米湯發酵乳的感官、理化及微生物指標

按照國標GB 19302—2010[8]的方法測定米湯發酵乳的感官、理化及微生物指標。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從貴州“米酸湯”“紅酸湯”樣品中分離純化出16株菌株，其中“米酸湯”中7株，“紅酸湯”中9株，分別命名為M-14-3-3，M-14-3-2，M-14-3-1，M-4-7-3，M-4-7-4，M-4-3-2，M-4-3-1，M17-6-3-6，M17-6-3-2，P-1-3-2，P-3-3-2，P-3-3-7，L-4-3-4，L-14-3-3，L-14-7-4，L-4-3-3，對分離的菌株進行革蘭氏染色發現，16株菌株為革蘭氏陽性，無運動性，過氧化氫酶試驗為陰性，KOH試驗為陽性，均產酸；綜合分析將16菌株初步判定為乳酸菌。

分離菌株的典型形態（光鏡×1 600倍）見圖1。

圖1 分離菌株的典型形態（光鏡×1 600倍）

2.2 乳酸菌的產酸能力

16株乳酸菌在12%全脂復原乳中，于37℃下培養10 h內的酸度變化如表3所示；測定菌株培養60 h后的最大產酸量。

乳酸菌的產酸能力見表3，菌株最大產酸量見表4。

由表3可知，大部分菌株發酵10 h的酸度均大于70°T，通過分析還發現，菌株M-14-3-3，M-14-3-1，M-4-7-3，M-4-7-4，M-4-3-1，M17-6-3-6， M17-6-3-2， P-1-3-2， P-3-3-2， P-3-3-7，L-14-3-3，L-4-3-3的最大產酸速率分別為9.00，7.81， 9.39，8.10， 9.65，7.49， 8.99， 5.75，8.55，10.75，8.26 °T/h。M-14-3-3，P-3-3-7 的產酸速率中等，而Anne Saint-eve等人[9]的研究發現，中等產酸速率的菌株能使酪蛋白膠束更穩定且蛋白質網絡結構更為堅固。

由表4可知，菌株M-14-3-3，P-3-3-2及P-3-3-7的最大產酸量顯著高于其他菌株（p＜0.05），分別為177.64，171.66，176.94°T。根據上述試驗結果，選取產酸量大及產酸速率中等的M-14-3-3和P-3-3-7這2株菌株進行下一步試驗。

表3 乳酸菌的產酸能力/°T

表4 菌株最大產酸量/°T

2.3 米湯發酵乳的發酵工藝

分別將菌株M-14-3-3，P-3-3-7及其混合后（比例分別為1∶1，2∶1，1∶2） 進行發酵，研究不同的接種量、米湯添加量、發酵時間、發酵溫度及白砂糖添加量對米湯發酵乳感官的影響。

米湯發酵乳的評分結果見圖2，米湯發酵乳工藝條件正交試驗見表5，感官評分直觀分析見圖3。

由圖2（a） 可知，當菌株M-14-3-3，P-3-3-7以1∶1的比例發酵米湯時，其感官評價得分大于單一菌株及其他混合比例發酵；據圖2（b） 可知，米湯發酵乳發酵16 h時的感官得分最高，之后評分下降；由圖2（c）可知，米湯發酵乳在37℃發酵時感官得分最高，之后評分下降；由圖2（d） 可知，米湯發酵乳的感官評分隨米湯添加量的增加而增加，當米湯添加量為20%時達到最高，之后開始下降；由圖2（e）可知，當白砂糖的添加量為9%時，感官評分最高；由圖2（f）可知，米湯發酵乳的感官評分隨接菌量的增加而增加，當接菌量為4%時，感官評分最高。

對米湯和白砂糖添加量、發酵時間及溫度進行正交試驗發現（表5），米湯添加量、白砂糖添加量等因素對米湯發酵乳的感官評價均具有較大影響；表5及圖2表明，米湯發酵乳感官評分的較佳工藝參數組合為A2B1C3D2，即米湯添加量20%，白砂糖添加量8%，發酵時間15 h，發酵溫度37℃。

2.4 米湯發酵乳產品品質及貯藏特性

2.4.1 米湯發酵乳的產品品質

米湯發酵乳的感官指標見表6，米湯發酵乳的理化指標見表7，米湯發酵乳的微生物指標見表8。

圖2 米湯發酵乳的評分結果

表5 米湯發酵乳工藝條件正交試驗

圖3 感官評分直觀分析

表6 米湯發酵乳的感官指標

表7 米湯發酵乳的理化指標

表8 米湯發酵乳的微生物指標

由表6可以看出，米湯發酵乳呈乳白微黃色，具有米湯特有的清香，組織細膩、表面光滑，凝乳均勻、無分層、無乳清析出；由表7可知，米湯發酵乳的酸度和黏度分別為94.8°T，1 236 cP，均在參考標準內；蛋白質及脂肪的含量分別為2.56%，3.35%，均高于參考標準；由表8可知，乳酸菌數為1.5×108CFU/mL，高于參考標準，而大腸桿菌落數為0，低于參考標準；因此，米湯發酵乳的感官、理化及微生物指標均符合風味發酵乳產品的國標標準。

2.4.2 米湯發酵乳的貯藏特性

米湯發酵乳的貯藏特性見表9。

表9 米湯發酵乳的貯藏特性

由表9數據可以看出，米湯發酵乳在貯藏期內的貯藏特性比較好，15 d后的活菌數較高，為7.5×107CFU/mL；后酸化程度較低，酸度為117.3°T，黏度隨著貯藏時間的增加而增加，15 d后的黏度為1 670 cP。

3 結論

相關研究發現，乳酸菌發酵含有米湯的牛乳，其VC、葉酸和β-胡蘿卜素的含量更豐富[10]，而VC能夠促進膠原蛋白的合成，增強機體對外界環境的抗應激能力和免疫力，促進氨基酸代謝和改善鈣、鐵吸收；葉酸對嬰幼兒神經細胞和腦細胞發育有促進作用和抗腫瘤作用，缺乏可引起巨紅細胞性貧血及白細胞減少癥；β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，具有解毒作用，是維護人體健康不可缺少的營養素，對抗癌、預防心血管疾病、白內障及抗氧化有顯著功能[11]。同時所含有的有益菌群，同豐富的營養成分一起對調整人體腸道微生態平衡、促進人體健康及預防消化道疾病也具有不可忽視的作用。

由于米湯有豐富的維生素和水溶性膳食纖維，含有促進乳酸菌生長的生長因子，添加到發酵乳中，能夠促進乳酸菌生長繁殖，且具有良好的色澤與特別的滋氣味，使發酵乳帶有天然的乳白色和大米的特殊清香，使得發酵乳既具有誘人的色澤，又酸甜可口。但是，當米湯添加過量時，會對乳酸菌的生長產生較大的影響，使得發酵乳過酸，析出乳清，同時酸味與過濃郁的米湯滋氣味相結合，會導致不愉悅的口感與口味的產生。因此，在實際生產中，米湯添加量對米湯發酵乳的口味產生了至關重要的影響；溫度對于米湯發酵乳的發酵有較大影響，溫度過高會導致酸化過快，不利于風味物質形成，同時也不利于胞外多糖的產生及發酵乳黏度的形成；而一定量的白砂糖既能改善發酵乳的風味又能促進產酸，但白砂糖濃度過高時可以抑制產酸量和細菌生長。

從貴州“米酸湯”“紅酸湯”中分離篩選獲得的菌株M-14-3-3和P-3-3-7的產酸量較大、產酸速率中等，以4%接種量發酵的米湯發酵乳具有米湯特有的清香、組織細膩、表面光滑、無乳清析出，其酸度和黏度適中，蛋白質及脂肪的含量等理化及微生物指標符合國家標準，乳酸菌活菌數較高；且在貯藏期內理化及微生物指標均符合風味發酵乳的國家標準；其他營養成分在后期試驗中還需進一步分析。

[1]李劍欣，張緒梅，徐琪壽.色氨酸的生理生化作用及其應用 [J].氨基酸和生物資源，2005，27（3）：58-62.

[2]陳大衛.輔助降血脂益生乳酸菌的篩選及其對高血脂大鼠腸道菌群的影響 [D].揚州：揚州大學，2014.

[3]石敏，張文學，袁瑋，等.“凱里米酸湯”發酵過程中主要微生物及營養成分研究 [J].中國調味品，2014，39（9）：16-19.

[4]張璇.貴州“紅酸湯”半成品中微生物區系的研究 [D].重慶：西南大學，2011.

[5]王友湘，陳慶森，閻亞麗.用于乳酸菌分離鑒定的幾種培養基的篩選及應用 [J].食品科學，2007，28（9）：374-377.

[6]布坎南R E，吉布斯N E.伯杰氏細菌鑒定手冊 [M].第8版.中國科學院微生物研究所,譯.北京：科學出版社，1984：660-721.

[7]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.239—2016食品酸度的測定 [S].北京：中國標準出版社，2016.

[8]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 19302—2010食品安全國家標準——發酵乳[S].北京：中國標準出版社，2010.

[9]Anne Saint-eve，Nathalie Martin，Hervé Guillemin，et al.Flavored yogurt complex viscosity influences real-time aroma release in the mouth and sensory properties[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，2006，54（20）：794-803.

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Screening on Lactic Acid Bacteria of Rice Water Fermented Milk and its Processing

CHEN Dawei，YANG Zhuangzhuang，HUANG Yujun，WA Yunchao，ZHANG Yulv，DU Yangyang，LI Chunyu
（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

Lactic acid bacteria （LAB） were screened from sour soup in Guizhou，and the rice water content，fermentation time，addition content of sucrose and other effects of process conditions on rice fermented milk sensory characteristics were studied，and the optimum formula of rice fermented milk were confirmed.The results showed that the obtained strains M-14-3-3 and P-3-3-7 were suitable for rice fermented milk fermentation，which was delicate taste，sweet and sour with suitable mouth and with the unique fragrance of rice when the rice water content 20%，sucrose 8%，and the inoculation amount of proportion of strains（1∶1） 4%，37 ℃ fermentation 15 h，and acidity 94.8 °T，viscosity 1 236 cP，viable count of LAB 1.5×108CFU/mL，and physicochemical and microbial indexes were in line with national standards.The rice fermented milk had the good storage characteristics in the 15 days storage period，which the viable count 7.5×107CFU/mL， the acidity 117.3 °T，and the viscosity 1 670 cP.

rice soup；fermented milk；fermentation process

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.007

1671-9646（2017） 12a-0022-05

2017-10-09

國家自然科學基金青年基金項目（31701627）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（17KJB550009）；江蘇省高校自然科學研究重大項目（17KJA550004）；揚州大學大學生科技創新基金“益生菌發酵果蔬汁的制備及活性物質的研究”（201605）；揚州大學教改課題博士專項課題（YZUJX2017-17B）。

陳大衛（1986— ），男，博士，講師，研究方向為乳品科學。