姜黃素通過調控JAK2/STAT3信號通路對高糖環境下心肌細胞生物學特性的影響

鄧士兵 夏 豪 周忠泉

(武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060)

姜黃素通過調控JAK2/STAT3信號通路對高糖環境下心肌細胞生物學特性的影響

鄧士兵 夏 豪 周忠泉

(武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060)

目的探討姜黃素對高糖環境下的心肌細胞生物學特性影響。方法以心肌細胞HCM為研究對象，分別用高糖和低糖細胞生長液培養心肌細胞，同時在細胞生長液中加入姜黃素。MTT檢測作用24 h、48 h、72 h的細胞增殖情況。流式細胞儀檢測48 h的心肌細胞凋亡情況。DCFH-DA探針檢測心肌細胞內活性氧水平。Western印跡檢測相關蛋白表達水平。結果高糖組心肌細胞增殖與對照組相比明顯受到抑制(Plt;0.01)。實驗組中心肌細胞增殖情況明顯高于高糖組(Plt;0.01)。高糖組心肌細胞凋亡率明顯高于對照組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞凋亡率明顯低于高糖組(Plt;0.01)。高糖組心肌細胞中Bcl-2的表達水平明顯低于對照組(Plt;0.01)；高糖組心肌細胞中Bax的表達水平明顯高于對照組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞中Bcl-2的表達水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞中Bax的表達水平明顯低于高糖組(Plt;0.01)。高糖組心肌細胞中熒光強度明顯高于對照組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞中熒光強度明顯低于高糖組(Plt;0.01)。對照組、高糖組和實驗組心肌細胞中JAK2、STAT3表達水平沒有明顯變化。高糖組心肌細胞中p-JAK2、p-STAT3表達水平顯著低于對照組(Plt;0.01)。實驗組心肌細胞中p-JAK2、p-STAT3表達水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)。結論高糖對心肌細胞增殖具有抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用。姜黃素可以通過作用于JAK2/STAT3信號通路改善高糖環境下的心肌細胞損傷。

心肌細胞；姜黃素；增殖；活性氧

糖尿病性心肌病變是一種發生于糖尿病患者的特殊的心肌性疾病，主要表現為心室舒張功能異常〔1〕。心肌細胞在糖尿病性心肌病變中發揮重要作用〔2〕。糖尿病大鼠模型中，心肌細胞出現明顯的凋亡現象〔3〕。心肌細胞的凋亡與心肌肥厚、心力衰竭、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關〔4〕。姜黃素(Curcumin)提取自姜科植物，可以降低小鼠心肌纖維化的程度，對心臟具有一定的保護作用。姜黃素除了具有保護心臟大血管的作用外，對心肌細胞損傷也具有一定的保護作用〔5〕。姜黃素可以通過調控相關的蛋白激酶活性作用于心肌細胞〔6〕。本研究探討姜黃素對心肌細胞的作用機制，以期為治療糖尿病心肌病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人心肌細胞(HCM)購自中國醫學科學院。

1.1.2主要儀器及試劑 姜黃素購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胰蛋白酶、青鏈霉素、DMEM-F12、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Simga；p-JAK2單克隆抗體、JAK2單克隆抗體、p-STAT3單克隆抗體、STAT3單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Cell Signaling；CO2培養箱、流式細胞儀均購自美國Thermo。

1.2方法

1.2.1細胞培養 保存于液氮管中的心肌細胞HCM放在37℃的孵育器中融化，加入含有胎牛血清濃度為10%的DMEM-F12細胞生長液，充分混合后，轉移到離心管中，1 000 r/min離心10 min后，棄掉上清液，用細胞生長液懸浮細胞，種植于細胞培養瓶中，培養條件是37℃，5% CO2培養箱。觀察細胞濃度為90%時，倒掉細胞生長液，加入0.125%胰蛋白酶消化細胞后，離心，用細胞生長液懸浮細胞，轉移到細胞培養瓶中繼續培養。

1.2.2噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 將培養至對數生長期的心肌細胞分為三組，分別為對照組、高糖組、實驗組。對照組中心肌細胞培養液用正常的含有D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的細胞生長液，高糖組和實驗組心肌細胞用含有D-葡萄糖濃度為30 mmol/L的細胞生長液。實驗組中加入姜黃素使其終濃度為0.5 μg/ml。同時設置空白組，空白組不加入細胞，加入等量的細胞生長液。將各組細胞接種到96孔細胞培養板中，每毫升細胞生長液中含有細胞個數為1×105個。培養細胞48 h后，在細胞中加入MTT溶液20 μl。放在37℃孵育反應4 h。倒掉上清液，加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，酶標儀檢測每孔中的吸光度。計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 取培養48 h的各組心肌細胞，加入0.125%胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，在細胞中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮細胞，離心后，棄上清液。加入適量的PBS使細胞濃度為1×105個/ml。混合均勻后，取1 ml細胞懸浮液，收集細胞，加入PI和Annexin V各5 μl，充分混合，放在室溫環境下孵育反應15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4DCFH-DA探針檢測活性氧水平 取培養48 h的心肌細胞，經0.125%胰蛋白酶消化后，將細胞接種于六孔細胞培養板中，放置于37℃，5% CO2培養箱中培養。吸除細胞培養板中的細胞生長液，在每孔中加入1 ml的DCFH-DA(10 μmol/L)，放置于37℃孵育反應30 min后，期間每5 min震蕩混勻1次。在細胞中加入不含有胎牛血清的細胞生長液洗滌細胞兩次，放置于顯微鏡下觀察后，用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度。

1.2.5Western印跡檢測p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Bcl-2、Bax表達水平 處于對數生長期的心肌細胞，棄掉細胞生長液，在細胞中加入細胞裂解液，放置于冰上孵育裂解50 min，轉移細胞裂解液至離心管中，放置于4℃，16 000 r/min離心15 min。吸取蛋白上清，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。提取的蛋白經變性后，加入到上樣孔中，每孔加入變性蛋白樣品50 μl。SDS-PAGE電泳初始電壓為80 V，終末電壓為120 V。電泳結束后，取出蛋白凝膠，按照常規方法轉膜，4℃轉膜過夜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜經封閉液封閉后，加入一抗孵育反應后，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，加入辣根過氧化物標記的二抗反應后，滴加顯色劑，在暗室中曝光，分析蛋白表達水平。

1.3統計學方法 應用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1MTT檢測細胞增殖結果 高糖組心肌細胞增殖與對照組相比明顯受到抑制(Plt;0.01)，并且高糖對心肌細胞具有一定的毒性作用。實驗組中加入了姜黃素，心肌細胞增殖明顯高于高糖組(Plt;0.01)。見表1。

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡結果 高糖組心肌細胞凋亡率明顯高于對照組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞凋亡率明顯低于高糖組(Plt;0.01)。Western印跡結果顯示，高糖組心肌細胞中Bcl-2的表達水平明顯低于對照組(Plt;0.01)；高糖組心肌細胞中Bax的表達水平明顯高于對照組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞中Bcl-2的表達水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)；實驗組心肌細胞中Bax的表達水平明顯低于高糖組(Plt;0.01)。見表2。

表1 各組細胞OD值

與對照組比較：1)Plt;0.01；與高糖組比較：2)Plt;0.01；下表同

表2 細胞凋亡率及Bcl-2、Bax表達水平

2.3DCFH-DA探針檢測活性氧水平結果 高糖組心肌細胞中熒光強度(19.64±1.58)明顯高于對照組(10.02±1.05，Plt;0.01)；實驗組心肌細胞中熒光強度(14.68±1.23)明顯低于高糖組(Plt;0.01)。

2.4Western印跡法檢測p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達結果 對照組、高糖組和實驗組心肌細胞中JAK2、STAT3表達水平沒有明顯變化；高糖組心肌細胞中p-JAK2、p-STAT3表達水平顯著低于對照組(Plt;0.01)，實驗組心肌細胞中p-JAK2、p-STAT3表達水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)。見表3。

表3 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3表達水平

3 討 論

姜黃素作為一種植物色素，具有安全無毒的優點，臨床上廣泛用于腫瘤的治療。姜黃素對癌細胞增殖、侵襲和轉移具有抑制作用〔7〕。姜黃素促進大鼠神經干細胞的增殖分化，具有治療阿爾茲海默氏病的作用〔8〕。有研究表明，姜黃素可以有效改善果糖攝入過多引發的腎臟損害，對心肌缺血損傷具有明顯的治療作用〔9〕。本研究結果發現，高糖環境下心肌細胞增殖明顯受到抑制，并且高糖環境對細胞造成了一定的毒性作用。在細胞中加入姜黃素后，高糖環境對心肌細胞的增殖抑制作用明顯減弱。

細胞凋亡是一種受多種基因共同調控的細胞死亡。細胞凋亡異常與疾病的發展具有密切關系。Bcl-2蛋白家族是目前研究最多的凋亡相關蛋白。根據細胞凋亡過程中的作用，可以將Bcl-2蛋白家族分為兩種，一種是抑制細胞凋亡的蛋白，一種是促進細胞凋亡的蛋白〔10〕。Bcl-2在細胞凋亡過程中發揮抑制作用，而Bax在細胞凋亡過程中發揮促進作用〔11〕。本研究結果發現，高糖環境下心肌細胞凋亡增多，而加入姜黃素后的心肌細胞凋亡程度有所減弱；進一步研究發現，高糖環境下Bcl-2蛋白表達下降，而Bax蛋白表達升高。加入姜黃素后的心肌細胞中Bcl-2蛋白表達增多，Bax蛋白表達減弱。說明姜黃素抑制高糖環境下的心肌細胞凋亡是通過作用于Bcl-2、Bax蛋白表達實現的。

氧化應激導致的活性氧增多是糖尿病患者機體損傷的重要組成部分。高糖環境下，抗氧化酶活性受到抑制，導致機體內氧化環境平衡失調。檢測活性氧水平的高低可以間接反映心肌細胞的損害程度〔12〕。活性氧水平越高，說明心肌細胞損害程度越大。本研究高糖環境中心肌細胞中的活性氧水平升高，加入姜黃素后的心肌細胞中活性氧水平出現明顯下降。提示高糖環境對心肌細胞具有一定程度的氧化損傷，而姜黃素可以有效減緩這一損傷。

酪氨酸蛋白激酶2/信號轉導子和轉錄激活子(JAK2/STAT3)參與細胞凋亡的信號轉導〔13〕。JAK蛋白家族廣泛存在于細胞質中，由JAK1、JAK2、JAK3和TYR2組成〔14〕。STAT3是STAT蛋白家族中的一員。JAK2/STAT3參與機體氧化應激反應、胚胎發育、組織器官形成和細胞凋亡、細胞損傷等一系列生命活動。JAK2/STAT3參與腫瘤、腎臟疾病、肝炎、心血管疾病的發生。本研究發現高糖環境下心肌細胞中p-JAK2、p-STAT3表達水平有所下降，而姜黃素可以有效抑制高糖環境造成的這種變化。說明高糖環境下，JAK2/STAT3信號通路受到抑制，姜黃素可以激活JAK2/STAT3信號通路發揮生物學作用。

綜上所述，高糖環境對心肌細胞增殖有抑制作用，對心肌細胞凋亡具有促進作用。姜黃素可以通過作用于JAK2/STAT3信號通路緩解高糖環境下心肌細胞增殖抑制、凋亡增多，對心肌細胞損傷具有一定的改善作用。

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〔2017-06-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

R542.2

A

1005-9202(2017)22-5490-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.003

國家自然科學基金(No.81270184)；國家留學回國人員科技活動項目(No.國人廳〔2006〕164號)

夏 豪(1966-)，男，博士，主任醫師，主要從事心血管內科疾病研究。

鄧士兵(1982-)，男，主治醫師，主要從事心血管內科、冠脈介入和心力衰竭研究。