轉化生長因子β1對老年心房顫動患者內皮細胞向間質成纖維細胞轉化的影響

葛衛力 米亞非 朱 敏 陸抑非 李 濤 江建軍

(溫州醫科大學附屬臺州醫院心內科，浙江 臺州 317000)

轉化生長因子β1對老年心房顫動患者內皮細胞向間質成纖維細胞轉化的影響

葛衛力 米亞非 朱 敏1陸抑非 李 濤 江建軍

(溫州醫科大學附屬臺州醫院心內科，浙江 臺州 317000)

目的探討轉化生長因子(TGF)β1對老年心房顫動患者內皮細胞向間質成纖維細胞轉化的影響。方法選擇老年陣發性心房顫動患者100例及持續性心房顫動患者100例，分離循環血內皮細胞，將其分為對照組〔加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)培養〕和TGF-β1組(加入TGF-β1 10 ng/ml培養)。采用MTT實驗測定細胞增殖，transwell實驗測定細胞遷移，免疫熒光染色觀察CD31和vimentin表達，Western印跡法測定CD31、vimentin、ve-cadherin和α-平滑肌肌動蛋白(SMA)含量。結果TGF-β1組吸光度A值明顯低于對照組(Plt;0.05)，穿膜細胞數高于對照組(Plt;0.05)。免疫熒光染色顯示：和對照組比較，TGF-β1組間質細胞特異性蛋白vimentin表達明顯升高、內皮細胞特異性蛋白CD31表達明顯降低；對照組含極少vimentin和CD31雙陽性細胞，TGF-β1組vimentin和CD31雙陽性細胞明顯增多。Western印跡檢測結果顯示，TGF-β1組CD31和ve-cadherin明顯低于對照組(Plt;0.05)，間質細胞標志性蛋白vimentin和α-SMA明顯高于對照組(Plt;0.05)。結論TGF-β1可誘導老年心房顫動患者內皮細胞向間質化細胞轉化。

心房顫動；內皮細胞；轉化生長因子β1；心肌纖維化

心房顫動是最常見的心律失常類型，在老年人中多見，多數心房顫動患者早期呈陣發性，隨著疾病的發展，最后轉化為持續性心房顫動，心房顫動增加腦卒中和死亡的危險。和非心房顫動患者比較，心房顫動患者的心房組織纖維化和膠原增生更嚴重〔1〕，成纖維細胞增殖并分泌膠原蛋白是心肌纖維化和心肌重構的基礎。心房顫動患者存在內皮系統功能異常，在間質纖維化過程中，內皮細胞-間質成纖維細胞轉化發揮重要作用〔2～4〕。本文觀察轉化生長因子(TGF)β1對老年心房顫動患者內皮細胞向間質成纖維細胞轉化的影響。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑 選擇溫州醫科大學附屬臺州醫院2013年1月至2014年12月70歲以上老年心房顫動患者200例，包括陣發性心房顫動患者100例和持續性心房顫動患者100例，并選擇性別、年齡相匹配的健康體檢者100例作為對照組。所有入選者簽署知情同意書，經我院倫理委員會審批。排除標準：資料不全者、慢性阻塞性肺疾病者、起搏器攜帶者、曾行心房顫動消融治療者，合并中重度瓣膜疾病者，原發性甲狀腺功能亢進或減退者，3個月內有心肌病、心肌炎、急性冠狀動脈綜合征、心肌梗死史者，惡性腫瘤者，糖尿病、高血壓、高脂血癥和動脈粥樣硬化，近期服用激素或抗炎藥物者，近期有感染史或手術外傷史者。主要試劑：Dylight熒光二抗、Hochest33342、鼠抗人CD31抗體、兔抗人vimentin抗體、兔抗人ve-cadherin抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2研究方法 心房顫動組抽取入院第2天空腹外周靜脈血。循環血內皮細胞分離和鑒定：將3 ml抗凝循環血用Hanks稀釋1倍，經Percon密度梯度離心法分離并收集細胞，移至細胞培養瓶中培養，待細胞達80%左右融合時進行傳代培養，取第4代細胞進行實驗。鑒定：在24孔板上制細胞爬片，封閉后加入兔抗人血管性血友病因子(vWF)相關抗原過夜孵育，加入Hochest33342核染，加入Dylight熒光二抗孵育，顯微鏡下觀察。細胞分組：將細胞分為對照組和TGF-β1組，TGF-β1組加入TGF-β1 10 ng/ml，對照組加入等量PBS液。細胞增殖實驗：將兩組細胞接種到96孔板中(每孔1×105個細胞)，每組設7個復孔，培養12 h、饑餓24 h，加入TGF-β1或PBS液繼續培養48 h，加入MTT試劑放置2.5 h，酶標儀測量490 nm吸光度A值。細胞遷移實驗：將兩組細胞接種到24孔板中(每孔5×104個細胞)，每組設7個復孔，培養12 h、饑餓24 h，加入TGF-β1或PBS液繼續培養48 h，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，在transwell小室上室加入細胞懸液100 μl，下室加入含FBS培養基，培育24 h后多聚甲醛固定，結晶紫染色后計數穿膜細胞數。免疫熒光染色：在24孔板上制細胞爬片，每組設7個復孔，培養48 h后固定封閉，加入vWF、CD31、vimentin、ve-cadherin、α-SMA一抗過夜孵育，加入Hochest 33342核染，加入熒光二抗孵育，熒光顯微鏡下觀察單染情況；免疫熒光雙染步驟和單染步驟相同，一抗為CD31和vimentin混合一抗。兩組細胞CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白測定：提取兩組細胞蛋白質，采用Western印跡測定CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白含量，以β-actin為內參照。Gelpre32分析軟件對各蛋白灰度值進行分析，蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1光鏡下細胞形態學變化及鑒定 光鏡下內皮細胞邊界清楚，呈多邊形，為集落式生長(見圖1)，TGF-β1誘導48 h后，細胞間隙增大，向邊界遷移擴散，部分細胞形態變為梭形。第4代內皮細胞vWF相關抗原陽性率為(0.08±0.02)%。

圖1 各組內皮細胞呈集落樣生長(DAB，×200)

2.2兩組細胞增殖和細胞遷移結果比較 TGF-β1組吸光度A值顯著低于對照組(t=24.132，P=0.000)，穿膜細胞數顯著高于對照組(t=37.745，P=0.000)。見表1。

表1 兩組細胞增殖和細胞遷移結果比較

2.3免疫熒光實驗結果 CD31和vimentin單染結果顯示：培養48 h后，和對照組比較，TGF-β1組間質細胞特異性蛋白vimentin表達升高、內皮細胞特異性蛋白CD31表達降低；雙染結果顯示：對照組含極少vimentin和CD31雙陽性細胞，而TGF-β1組vimentin和CD31雙陽性細胞明顯增多。見圖2。

圖2 細胞免疫熒光標記鑒定CD31、vimentin雙陽性的內皮細胞(×400)

2.4兩組細胞CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白表達比較 TGF-β1組內皮細胞特異性標志蛋白CD31和ve-cadherin明顯低于對照組，間質細胞標志性蛋白vimentin和α-SMA明顯高于對照組(Plt;0.05)。見表2。

表2 兩組CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白表達比較

3 討 論

代謝性疾病患者具有內皮功能不全的特點，內皮功能不全人群心房顫動的發生率增加〔5，6〕，研究發現代謝綜合征患者和正常人群相比心房顫動的發生率高，和非糖尿病患者比較，糖尿病患者心房顫動的發生率增加〔7〕。心功能越差內皮功能不全越明顯，心房顫動的發生率隨著心功能的惡化而逐漸升高，他汀類藥物具有改善內皮功能的作用，有心房顫動病史的陣發性心房顫動、心臟外科手術、急性冠脈綜合征的患者給予他汀類藥物治療可降低心房顫動的發生風險〔8〕。正常情況下，血液中很少有內皮細胞脫落，當內皮收到損傷時內皮細胞脫落下來，使血液中內皮細胞數量增加，vWF為內皮損傷和功能障礙標志物，在心房顫動患者左心耳中的表達增加〔9～11〕。本研究顯示老年心房顫動患者存在內皮細胞損傷，細胞間通過一系列機制互相激活、損傷，使vWF、E-選擇素、細胞間黏附分子(ICAM)-1表達增加，使大量血小板和白細胞黏附在血管內皮，形成惡性循環。

炎癥反應和心房纖維化在心房顫動的發生發展中發揮重要作用，TGF-β1作為多效性炎性因子，參與心房纖維化過程，TGF-β1在生理性和病理性過度修復過程中產生過量細胞外基質，從而導致纖維化的發生，是膠原蛋白和細胞外基質沉積和合成的始動因子，可誘導肺成纖維細胞、肝成纖維細胞的遷移〔12，13〕。內皮細胞-間質細胞轉化和多種間質纖維化有關的疾病有關，傳統觀點認為纖維化的成纖維細胞來自胚胎期間質細胞，最近研究顯示在腎臟纖維化模型中，纖維化除了局部成纖維細胞增殖外，另一部分重要來源為內皮細胞轉化來的成纖維細胞，TGF-β1誘導的內皮細胞-間質細胞轉化在糖尿病腎臟纖維化的發展中發揮促進作用〔14〕。心內膜的內皮細胞通過內皮細胞-間質細胞轉化成為房室間隔、房室墊、瓣膜的間充質細胞，TGF-β1調節這一過程，內皮細胞轉化為心肌成纖維細胞稱為心肌纖維化的重要環節〔15，16〕。本研究發現TGF-β1誘導內皮細胞向間質細胞轉化，促進細胞增殖和遷移?？梢?，老年心房顫動患者血清TGF-β1水平增加，從而誘導內皮細胞向間質細胞轉化，啟動心房間質纖維化，從而在心房顫動的發生中發揮重要作用。改善內皮系統功能，阻止TGF-β1誘導的內皮細胞-間質細胞轉化可預防老年心房顫動的發生。

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〔2016-08-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R541.7+5

A

1005-9202(2017)22-5509-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.011

浙江省醫藥衛生科技計劃項目(2017KY164)

1 溫州醫科大學附屬臺州醫院醫學研究中心

江建軍(1965-)，男，碩士，主任醫師，主要從事冠心病介入治療研究。

葛衛力(1981-)，男，碩士，主治醫師，主要從事心房顫動發病機制研究。