辛伐他汀對快速起搏早期家兔心房肌超微結構的影響及可能機制

王聯發 陳 晨 王星星

(中國人民解放軍第105醫院心內二科，安徽 合肥 230031)

辛伐他汀對快速起搏早期家兔心房肌超微結構的影響及可能機制

王聯發 陳 晨 王星星

(中國人民解放軍第105醫院心內二科，安徽 合肥 230031)

目的建立家兔快速心房起搏模型，探討辛伐他汀對快速心房起搏早期心房超微結構及L型鈣通道α1c蛋白的影響。方法30只家兔隨機分為對照組、心房快速起搏組、辛伐他汀組各10只。辛伐他汀組5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃2 w，其余組以等量生理鹽水灌胃，對照組不行起搏，心房快速起搏組和辛伐他汀組行快速心房起搏(800次/min)建立家兔快速起搏模型，急性起搏8 h后取右房組織，電鏡觀察心房肌超微結構的改變，免疫組化法觀察急性起搏8 h后右房組織L型鈣通道α1c蛋白表達。結果心房快速起搏組起搏8 h后心房肌細胞超微結構有明顯變化，如肌原纖維排列紊亂、肌小節減少，肌溶解、線粒體腫脹、空泡樣改變、糖原聚集等心房結構重構的改變，心房肌細胞L型鈣通道的α1c亞單位的蛋白表達水平較對照組明顯下降。辛伐他汀組心房肌超微結構的改變相對較輕，L型鈣通道α1c亞單位的蛋白表達水平較對照組下降不明顯。結論辛伐他汀可明顯改善快速起搏早期家兔心房肌超微結構的變化，對快速心房起搏導致的L型鈣通道α1c亞單位的表達有一定保護作用。

辛伐他汀；快速起搏；心房重構；L型鈣離子通道

心房顫動(AF)是臨床最為常見、復雜的心律失常之一，隨年齡增加發病率逐步升高〔1〕。周自強等〔2〕調查表明，我國AF的患病率為0.77%，80歲以上人群AF患病率達7.5%。AF轉復后藥物維持竇性心律的只有65%，3年的維持率只有20%〔3〕。AF的發生及維持機制日益引起關注。AF可使心房發生電重構及結構重構，而心房重構發生的同時也加重AF的發生及維持。本文通過建立快速家兔起搏模型，觀察快速起搏早期心房肌超微結構的改變及辛伐他汀預處理對其影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新西蘭大耳白家兔30只，購自安徽醫科大學實驗動物中心，體重2.0～2.5 kg，雌雄不拘。30只家兔均分為對照組、心房快速起搏組、辛伐他汀組。辛伐他汀組5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃2 w，其余組以等量生理鹽水灌胃2 w。

1.2主要試劑、溶液成分 ①辛伐他汀片 (杭州默沙東制藥有限公司)；②山羊抗兔抗體 (美國Chemicon公司)；③液體石蠟、二甲苯、各濃度乙醇溶液、蘇木素、伊紅染液 (解放軍第105醫院病理實驗室提供)；④SP-900免疫組化染色試劑盒 (北京中杉金橋生物技術有限公司)；⑤3%戊巴比妥鈉溶液：戊巴比妥鈉3 g溶解100 ml無菌生理鹽水，常溫保存。⑥3%戊二醛溶液：30%戊二醛10 ml加入0.1 mmol/L二甲砷酸鈉緩液，定容至100 ml，避光保存于4℃冰箱。⑦10%甲醛：量取市售甲醛100 ml，加Na2HPO44 g、NaH2PO46.5 g及焦碳酸二乙酯(DEPC)水至1 000 ml，常溫保存備用。⑧二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑：取1 ml超純水，加入1滴試劑盒中A試劑，充分混勻在分別滴加B、C試劑各1滴，再次混勻，現配現用，配后避光保存。

1.3快速心房起搏模型的建立 各組家兔分別給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經耳緣靜脈注射麻醉，靜脈推注肝素1 000 U，將兔仰臥固定于兔臺，頸部正中切口，分離右側頸內靜脈并切開，近頭端結扎，置入1根5F四極電極導管(電極間距5 mm)至右房，插入深度約6 cm，將遠端電極對與心電圖左、右上肢電極相連，記錄家兔右心耳內膜心電圖，示大A小V，表明電極位于右心房，固定好電極導管。心房快速起搏組和辛伐他汀組采用心臟電生理刺激儀連續單刺激模式進行8 h的快速心房起搏，起搏頻率為800次/min，電壓4 V，對照組植入起搏電極，但不行高位快速右房起搏刺激，定時觀察家兔的反應狀態。

1.4標本的采集 根據實驗分組，分別在起搏8 h結束后，采用空氣栓塞法快速處死家兔，無菌技術開胸，迅速取出心臟，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗心臟，剪下右心房組織，用雙面刀片修成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，一部分于2.5%戊二醛4℃保存固定準備行電鏡觀察，一部分于10%甲醛中固定準備行HE染色及免疫組化試驗。

1.5電鏡觀察 梯度脫水后環氧樹脂包埋，制成超薄組織切片。醋酸雙氧鈾溶液和檸檬酸鉛溶液染色(鉛、鈾雙染色)，在JEM10OCX1I透射電鏡下，60～80 kV加速電壓，10 000～20 000放大倍率，觀察左房心肌細胞超微結構變化，選取典型視野拍照。

1.6HE染色 右心房組織存10%甲醛中固定24 h后，脫水、常規石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察細胞形態的完整性。

1.7免疫組化染色 固定好的家兔右心房心肌組織按HE染色方法脫水、包埋、切片，常規脫蠟脫水，滅活內源性過氧化物酶，滴加試劑A，37℃孵育30 min，滴加按適當比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜后置于37℃恒溫箱平衡40 min，PBS洗滌3 min×5次；滴加試劑B，37℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×5次；滴加試劑C，37℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×5次；DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。應用計算機輔助圖像分析系統進行分析，每組高倍鏡(放大400倍)下隨機選擇8個視野，計算每個視野L型鈣離子通道α1c亞單位蛋白表達平均光密度值，作為蛋白表達量。

1.8統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 實驗過程中，心房快速起搏組1只家兔在建模過程中死亡，解剖后考慮為心臟破裂導致大出血，又補充1只家兔，共有30只家兔建模成功，順利完成實驗。見圖1、圖2。

圖1 快速起搏前正常家兔心電圖(紙速 50 mm/s，Ⅱ導聯)

圖2 快速右心房起搏家兔心電圖(紙速 50 mm/s，Ⅱ導聯)

2.2各組心肌組織電鏡觀察 對照組心房組織在電鏡下見心肌纖維排列規則，無斷裂、溶解，肌小節明暗帶清楚，線粒體形態較規則。心房快速起搏組心肌纖維排列明顯紊亂，心肌纖維出現不同程度的損傷，包括肌纖維腫脹、斷裂、溶解；肌小節明暗帶不可區分；肌絲明顯減少；糖原聚集；線粒體腫脹、體積變大，部分破裂，數量減少，有的出現空泡樣改變。辛伐他汀組上述改變出現逆轉，明暗帶恢復，肌細胞排列比較整齊，但部分線粒體仍有異常，見圖3。

圖3 各組心肌組織電鏡觀察

2.3免疫組化觀察L型鈣離子通道α1c亞單位陽性表達情況 HE染色可見心房肌細胞排列規則，細胞大小勻齊。L型鈣離子通道α1c亞單位免疫組化陽性表達為棕褐色的細顆粒狀，主要分布在細胞膜和細胞質，縱切視野陽性顆粒沿細胞膜分布，橫切視野胞質陽性顆粒呈點狀散在，見圖4。對照組細胞膜和細胞質均有著色，分布較均勻，平均光密度0.245±0.014，心房快速起搏組陽性表達呈散在分布，較對照組明顯減少(0.133±0.007,Plt;0.05)，辛伐他汀組陽性表達較心房起搏組有改善(0.199±0.011，Plt;0.05)，說明辛伐他汀對快速心房起搏導致的L型鈣通道α1c亞單位的表達有一定保護作用。

圖4 心肌組織α1c亞單位免疫組化表達(SAB,×400)

3 討 論

AF的心房結構重構主要體現在心房組織、細胞、分子水平的心房大體結構和超微結構的病理改變，表現為細胞肥大、細胞內糖原累積、細胞超微結構的改變、內膜纖維化及脂肪組織浸潤等，并且與心房電重構密切相關，心房結構重構可致心房電傳導及興奮性異常，為AF的發生與維持提供了重要的病理基礎〔4〕。有研究發現〔5，6〕，當心房電重構被逆轉至正常后，AF的持續原因和結構重構若仍然存在，則仍較容易引發AF，提示心肌細胞的結構重構在AF維持和發展中起重要作用。一旦AF發生，它將引起心房電重構及結構重構，心房重構又為AF的維持提供了結構基礎，兩者互為因果，最終發展為永久性AF，形成“AF誘發AF”的惡性循環〔7～9〕。研究認為鈣超載在心房重構中起重要作用，在AF早期快速激動引起大量的鈣離子進入細胞內，造成鈣離子超載，導致線粒體等細胞器代謝異常及蛋白水解酶活性改變，產生肌小節缺失、肌溶解〔10〕；同時鈣超載導致的鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ磷酸化還能夠激活組蛋白去乙酰化酶(HDAC)下游效應器的重構，引起心房收縮功能異常〔11〕。其中L型鈣離子通道是決定心肌細胞內Ca2+含量和肌質網Ca2+釋放的主要通道〔12〕，L型鈣離子通道是一個由多種不同亞型構成的離子通道家族，而α1亞基為各種亞型鈣離子通道的核心組成部分，由其構成離子通道結構，并決定通道的電生理特性。本研究可見快速起搏家兔心房8 h即可出現心房肌組織重構，L型鈣離子通道α1c亞單位陽性表達明顯下調，與心房組織超微結構的變化相對應，因此推測α1c亞單位的表達改變可能是AF心房肌組織重構的分子基礎之一。辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑，廣泛應用于臨床，多用于阻滯膽固醇的合成、治療高脂血癥，近年來的研究發現，他汀類藥物具有除治療高脂血癥之外的其他方面的作用，并不依賴于降血脂功能，稱之為他汀的多效性〔13〕。2010年歐洲心臟病協會(ESC)AF指南〔14〕指出，通過動物實驗證實他汀類藥物具有較好的抗心律失常的作用，推薦作為AF一級預防和二級預防(上游治療)的重要藥物。Rader等〔15〕對200 例CABG 術后患者進行研究(其中50例在術后48 h內給予他汀類藥物)，結果顯示預防性給予他汀類藥物可以減少術后AF的發生和縮短患者的住院時間。

本研究提示辛伐他汀具有調節快速起搏家兔心房L型鈣通道α1c亞單位變化的作用，這可能為其抗心律失常的細胞學離子機制之一。

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〔2016-03-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R541.7

A

1005-9202(2017)22-5518-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.014

南京軍區聯勤部資助課題(No.11YG04)

王聯發(1967-)，男，主任醫師，碩士生導師,主要從事心臟起搏與心電生理研究。