桑葉總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α和腺苷酸活化蛋白激酶α2蛋白表達(dá)的影響

劉冬戀 凌保東 譚 林 楊春梅 楊 霞 游均梅

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610083)

桑葉總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α和腺苷酸活化蛋白激酶α2蛋白表達(dá)的影響

劉冬戀 凌保東 譚 林 楊春梅 楊 霞 游均梅

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610083)

目的探討桑葉總黃酮對(duì)2型糖尿病(T2DM)大鼠肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α2蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制。方法建立高脂飼料喂養(yǎng)且用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM雄性Wistar大鼠模型，將模型大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、二甲雙胍組(100 mg/kg灌胃)、桑葉總黃酮組(200，100，50 mg/kg灌胃)，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組。4 w后檢測(cè)大鼠空腹血糖(FPG)、血清胰島素(FINS)水平，Western印跡檢測(cè)肝臟PPARα和AMPKα2蛋白表達(dá)。結(jié)果桑葉總黃酮能降低T2DM大鼠的FPG、FINS水平，Western印跡顯示模型組大鼠肝臟PPARα和AMPKα2蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組均明顯下降(Plt;0.01)。經(jīng)桑葉總黃酮干預(yù)治療后，AMPKα2蛋白表達(dá)較模型組顯著增加(Plt;0.01)，PPARα蛋白水平改變不明顯(Pgt;0.05)。結(jié)論桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠有一定的治療作用，可能與其增加大鼠肝臟AMPKα2蛋白表達(dá)有關(guān)。

2型糖尿病；桑葉總黃酮；PPARα；AMPKα2

胰島素抵抗(IR)是多種疾病如2型糖尿病(T2DM)、肥胖、高血壓、高脂血癥、冠心病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。IR是T2DM發(fā)生和發(fā)展的基本因素，貫穿于T2DM的始終，目前IR是T2DM的研究熱點(diǎn)。桑葉是桑科桑屬植物桑Morus alba L.的樹葉，歷代中醫(yī)藥書中都有桑葉能夠治療消渴的記載。現(xiàn)代藥理研究證明桑葉具有降糖降脂的功能，可預(yù)防和治療糖尿病。桑葉總黃酮是桑葉中降糖降脂作用的主要成分。研究顯示〔1〕，桑葉總黃酮可以改善T2DM大鼠IR，緩解胰島 β 細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但其機(jī)制尚不明確。本研究探討桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠血糖、胰島素水平和大鼠肝臟PPARα和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α2蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和飼料 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠85只，體重180～200 g，購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào)：scxk(川)2009-09。在室溫(22±1)℃、相對(duì)濕度(55±5)%、光照周期12 h∶12 h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物 桑葉飲片購(gòu)自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：130624。用25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡1 h，超聲30 min，冷凝回流1.5 h，減壓回收至溶劑無(wú)醇味，然后用70%乙醇溶解，稀釋，作為上柱供試液，采用聚酰胺與D-101大孔樹脂聯(lián)用進(jìn)行精制，以80%乙醇洗脫，得到桑葉總黃酮，經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定其純度不低于50%。

1.3主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司；一抗兔抗大鼠PPARα、AMPKα2多克隆抗體購(gòu)自Abclonal公司；GAPDH內(nèi)參抗體羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德公司；硝酸纖維膜購(gòu)自美國(guó)Amersham公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購(gòu)自Pierce公司；大鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。

1.4T2DM大鼠模型的建立 85只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料(購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)喂養(yǎng)，其余75只高脂飼料(按照標(biāo)準(zhǔn)飼料59.8%，白糖15%，豬油10%，食鹽2%，膽固醇0.2%，酪蛋白7%，蛋黃粉5%配制)喂養(yǎng)，自由飲水，不應(yīng)用胰島素，保持墊料干燥，持續(xù)16 w后，將75只高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠小劑量腹腔注射STZ(35 mg/kg，溶于 0.1 mol/L，pH4.4檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液中)，誘導(dǎo)T2DM模型。腹腔注射STZ的第3天空腹12 h后測(cè)血糖，以空腹血糖(FPG)gt;11.1 mmol/L作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。2 w后再測(cè)血糖，血糖值居高不下證明模型穩(wěn)定，選入正式實(shí)驗(yàn)〔2〕。

1.5動(dòng)物分組 將入選正式實(shí)驗(yàn)的60只高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠隨機(jī)分為5組，即桑葉總黃酮高(200 mg/kg)，中(100 mg/kg)，低劑量組(50 mg/kg)，二甲雙胍組(100 mg/kg)，模型組，每組各12只，灌胃給藥。正常對(duì)照組及模型組按10 ml/kg灌服生理鹽水。給藥周期為4 w。在給藥期間，正常對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余各組大鼠給予高脂飼料。

1.6標(biāo)本收集 給藥4 w結(jié)束后，大鼠禁食12 h，尾靜脈取血測(cè)定FPG，然后用3%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，心臟取血，3 000 r/min離心15 min后分離血清，分裝后-80℃冰箱保存待測(cè)。取各組大鼠肝臟組織，樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干分裝于凍存管中-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.7血清空腹胰島素(FINS)水平測(cè)定 采用ELISA測(cè)定，再根據(jù)以下公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)：IRI=FPG×FINS/22.5和胰島素敏感指數(shù)(ISI)：ISI=ln〔1/(FPG×FINS)〕〔3〕。

1.8Western印跡檢測(cè)肝臟PPARα、AMPKα2蛋白表達(dá) 稱取30 mg肝臟組織(剔除筋膜、脂肪等組織)，以組織重量(g)∶裂解液體積(ml)=1∶10的比例加入裂解液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)各3 μl，電動(dòng)勻漿器以20 000 r/min轉(zhuǎn)速勻漿，上清液測(cè)定蛋白濃度，取20 μg煮沸變性5 min。然后經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在3%牛血清白蛋白(BSA)溶液中4℃振搖封閉30 min，洗膜后加入兔抗大鼠PPARα多克隆抗體(1∶1 000)或兔抗大鼠AMPKα2多克隆抗體(1∶1 500)4℃振搖過(guò)夜，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。洗膜后加ECL發(fā)光試劑，在ChemiDoc化學(xué)發(fā)光凝膠成像檢測(cè)儀中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用管家基因GAPDH作為蛋白上樣量對(duì)照，其余組與其相比得到相對(duì)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠血糖和INS的影響 見表1。與正常對(duì)照組相比，T2DM造模后各組血糖水平明顯升高；與模型組相比，經(jīng)桑葉總黃酮干預(yù)治療后，高、中劑量組血糖水平均明顯降低(Plt;0.01)。同時(shí)，模型組血清FINS及IRI明顯升高，ISI明顯下降(均Plt;0.01)，說(shuō)明模型組大鼠發(fā)生了IR，而給予桑葉總黃酮干預(yù)后，T2DM大鼠IR在一定程度上得到改善(Plt;0.01)。

表1 桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠血糖、INS及肝臟PPARα和AMPKα2蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較：1)Plt;0.01；與模型組比較：2)Plt;0.01

2.2桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠肝臟PPARα和AMPKα2蛋白表達(dá)的影響 見表1，圖1，圖2。與正常對(duì)照組相比，模型組肝臟PPARα和AMPKα2蛋白表達(dá)均明顯下降(Plt;0.01)。經(jīng)桑葉總黃酮干預(yù)治療后，AMPKα2蛋白表達(dá)較模型組顯著增加(Plt;0.01)，但PPARα蛋白水平改變不明顯(Pgt;0.05)。

1：正常對(duì)照組;2：模型組;3：二甲雙胍組;4：桑葉總黃酮高劑量組;5：桑葉總黃酮中劑量組;6：桑葉總黃酮低劑量組，下圖同圖1 桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠肝臟PPARα蛋白表達(dá)的影響

圖2 桑葉總黃酮對(duì)T2DM大鼠肝臟AMPKα2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

AMPK是一種重要的參與細(xì)胞調(diào)節(jié)代謝的應(yīng)激蛋白激酶，通過(guò)感受胞質(zhì)內(nèi)AMP/ATP比值的變化，調(diào)節(jié)骨骼肌、肝臟、脂肪組織等多種組織細(xì)胞內(nèi)的糖脂代謝。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，AMPK是由催化亞單位α和調(diào)節(jié)亞單位 β、γ 三個(gè)亞基構(gòu)成的異源三聚體〔4〕。其中α亞基又包括α1和α2兩個(gè)亞單位，在肝臟中α1和α2亞基的含量基本相同。在肝臟中，AMPK α亞基激活后能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制肝糖生成〔5〕，可能成為治療 T2DM的組織特異性靶點(diǎn)。有研究顯示高脂喂養(yǎng)可顯著降低大鼠肝臟AMPKα2 mRNA水平，而對(duì)AMPKα1的影響不如AMPKα2明顯，從而提示，與α1亞基相比，α2亞基與胰島素敏感性和機(jī)體糖代謝的關(guān)系更為密切〔6〕。而AMPKα2基因敲除的大鼠，出現(xiàn)了體重增加，血脂異常，胰島素敏感性下降和肝臟中甘油三酯堆積的現(xiàn)象〔7〕。本研究顯示，經(jīng)桑葉總黃酮干預(yù)治療后，肝臟中AMPKα2蛋白表達(dá)較模型組顯著增加，說(shuō)明桑葉總黃酮可能通過(guò)增加肝臟AMPKα2蛋白表達(dá)而治療T2DM。PPARα是PPARs家族的一個(gè)亞型，主要在分解代謝和糖異生活躍的器官如肝臟中有較高的表達(dá)。PPARα激活后對(duì)涉及脂肪酸攝取、結(jié)合、氧化和脂質(zhì)代謝等多個(gè)基因的表達(dá)都有調(diào)節(jié)作用，對(duì)改善血脂、維持脂代謝平衡有較為顯著的作用〔8〕。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，PPARα激動(dòng)劑能改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，具有適度的胰島素增敏作用〔9〕。另外，PPARα激動(dòng)后能調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素代謝，通過(guò)減輕脂肪酸介導(dǎo)、胰島素刺激的血糖在骨骼肌系統(tǒng)的分布而改善胰島素敏感性。因此PPARα的激動(dòng)和表達(dá)上調(diào)對(duì)T2DM患者改善血脂和IR方面起重要作用〔10〕。本研究同樣證實(shí)了在T2DM大鼠模型的肝臟中，出現(xiàn)了PPARα蛋白表達(dá)的下調(diào)。但是桑葉總黃酮干預(yù)治療后，PPARα蛋白表達(dá)雖有上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。近年來(lái)，關(guān)于PPARα與AMPKα的關(guān)系，有一些相關(guān)研究認(rèn)為，肝臟PPARα的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的增高與二甲雙胍介導(dǎo)的肝臟AMPKα基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的增高基本一致〔6〕，且AMPKα激活后可以增加PPARα的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平〔11〕。但是PPARα作為調(diào)節(jié)脂肪酸氧化的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，其與AMPKα之間的關(guān)系尚無(wú)一致結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)顯示桑葉總黃酮可以降低T2DM大鼠的FPG、FINS水平，上調(diào)AMPKα2蛋白的表達(dá)，從而對(duì)T2DM有一定的治療作用。

1穆曉燕，李先佳.桑葉總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013；11(19)：213-6.

2梁海霞，白海燕，李煥德，等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型穩(wěn)定性觀察〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008；24(4)：551-4.

3李光偉，潘孝仁，Lilloja S，等.檢測(cè)人群胰島素敏感性的一項(xiàng)新指數(shù)〔J〕.中華內(nèi)科雜志，1993；32(10)：652.

4Scott JW，Ross FA，Liu JK，etal.Regulation of AMP-activated protein kinase by a pseudesubstrate sequence on the gamma subunit〔J〕.EMBO，2007；26(3)：806-15.

5Andreelli F，F(xiàn)oretz M，Knauf C，etal.Liver adenosine monophosphate-activated kinase-alpha2 catalytic subunit is a key target for the control of hepatic glucose production by adiponectin and leptin but not insulin〔J〕.Endocrinology，2006；147(5)：2432-41.

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8苑留云.澤瀉湯對(duì)高脂血癥大鼠肝組織 PPARαmRNA、ACOmRNA 基因表達(dá)的影響〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

9石巧娟，劉月環(huán)，樓 琦，等.非酒精性脂肪肝大鼠PPAR-α 基因表達(dá)及脂代謝和胰島素水平的變化〔J〕.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009；19(8)：26-31.

10常 庚，潘 莉，王菊素，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)2型糖尿病大鼠模型PPARα/γ表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010；30(2)：354-8.

11Guo H，Sun S，Zhang X，etal.AMPK enhances the expression of pancreatic duodenal homeobox-1 via PPARalpha，but not PPARgamma，in rat insulinoma cell line INS-1〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010；31(8)：963-9.

〔2016-12-25修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

R587

A

1005-9202(2017)22-5521-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.015

四川省教育廳科研項(xiàng)目(No.16ZB0291)；成都醫(yī)學(xué)院校基金項(xiàng)目(No.CYZ15-15)

劉冬戀(1983-),女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究。