Kiss-1在胃腺癌組織中的表達及對胃腺癌MKN-45細胞增殖、遷移能力的影響

王 欣 李宜炯 龐 超 楊艷紅 張瑞華 朱振龍 王政民

(河北醫科大學第一醫院病理科，河北 石家莊 050031)

Kiss-1在胃腺癌組織中的表達及對胃腺癌MKN-45細胞增殖、遷移能力的影響

王 欣 李宜炯1龐 超 楊艷紅 張瑞華 朱振龍 王政民

(河北醫科大學第一醫院病理科，河北 石家莊 050031)

目的探討腫瘤抑制因子(Kiss)-1在胃腺癌組織中的表達及對胃腺癌細胞增殖、遷移能力的影響。方法qRT-PCR檢測50例胃腺癌組織和對應的癌旁組織中Kiss-1水平。分別將Kiss-1小干擾RNA(siRNA Kiss-1)和對照小RNA(siRNA control)、Kiss-1過表達載體(p EGFP-N1-Kiss-1)和對照空載體(p EGFP-N1)轉染至胃腺癌細胞株(MKN-45)中，培養48 h后，Western印跡檢測細胞中Kiss-1、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-連環蛋白(β-catenin)、C-myc蛋白水平，噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖能力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535作用胃腺癌細胞后，檢測細胞增殖和凋亡情況。結果Kiss-1在胃腺癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織(Plt;0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1組細胞存活率和遷移率顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1組細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。抑制劑作用后的胃腺癌細胞增殖遷移趨勢與p EGFP-N1-Kiss-1組一致。結論Kiss-1在胃腺癌組織中低表達，Kiss-1通過Wnt/β-catenin信號通路抑制胃腺癌細胞增殖遷移能力。

胃腺癌；腫瘤抑制因子；遷移；Wnt/β-catenin信號通路

胃腺癌是胃癌的一種，由胃腺體細胞惡化產生〔1〕。胃腺癌的發病率占全部胃癌發病率的95%〔1〕。腫瘤抑制因子(Kiss)-1最初發現于黑素瘤細胞株中，是一種與腫瘤轉移密切相關的基因〔3〕。Kiss-1廣泛存在于正常的組織和器官中，在小腸、胎盤、睪丸、腦等組織中均具有不同程度的表達〔4〕。研究表明，Kiss-1參與膀胱癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌等多種癌癥的轉移，在乳腺癌細胞、宮頸癌細胞增殖遷移過程中發揮抑制作用〔5，6〕。本研究運用qRT-PCR檢測胃腺癌組織中Kiss-1水平，并探討Kiss-1對胃腺癌細胞增殖遷移的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 組織及細胞：收集2010年8月至2013年3月在河北醫科大學第一醫院確診切除的50例胃腺癌患者的胃腺癌組織和對應的癌旁組織，其中男33例，女17例，平均年齡(58.47±12.34)歲。胃腺癌細胞株(MKN-45)購于河北醫科大學病理教研室。主要儀器及試劑：p EGFP-N1-Kiss-1由本實驗室保存；胰蛋白酶、DMEM、青鏈霉素均購于美國Sigma；Kiss-1、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-連環蛋白(β-catenin)、C-myc單克隆抗體均購于北京鼎國生物科技有限公司；CO2培養箱購于美國Thermo；倒置顯微鏡購于日本尼康。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測組織中Kiss-1水平 50例胃腺癌組織和對應的癌旁組織剪碎后，在液氮中研磨成粉狀。取出100 mg組織粉末，加入Trizol裂解液1 ml，依次用氯仿、異丙醇抽提后，用乙醇洗滌。加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，用紫外分光光度計檢測提取的RNA。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成Kiss-1 cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書分析Kiss-1 mRNA水平。Kiss-1上游引物：5′-CCTCTGTGCCACCCACTTTG-3′；Kiss-1下游引物：5′-TGTAGTTCGGCAGGTCCTTCT-3′。

1.2.2細胞培養 取出保存在液氮罐中的胃腺癌MKN-45細胞，迅速放在37℃的水浴鍋中融化后，加入含有10%胚牛血清(FBS)的DMEM細胞培養液，1 000 r/min離心10 min，加入5 ml細胞生長液懸浮細胞，種植于細胞培養瓶中，放置37℃，5% CO2培養箱中培養。觀察細胞密度達到90%時，棄去細胞培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入細胞培養液懸浮細胞，接種到細胞培養瓶中培養。

1.2.3細胞轉染 收集培養至對數生長期的胃腺癌MKN-45細胞，加入細胞生長液，接種到6孔細胞培養板中，放在37℃，5% CO2培養箱中培養24 h。分別將Kiss-1小干擾RNA(siRNA Kiss-1)和對照小RNA(siRNA control)、Kiss-1過表達載體(p EGFP-N1-Kiss-1)和對照空載體(p EGFP-N1)轉染至胃腺癌細胞中，放置于37℃培養6 h后，更換成完全培養液繼續培養。

1.2.4Western印跡檢測轉染后細胞中Kiss-1水平 收集轉染48 h后的胃腺癌細胞，加入細胞裂解液，放置于冰上裂解細胞30 min。轉移細胞裂解液至離心管中，4℃，12 000 r/min離心20 min。取蛋白上清液至EP管中。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白樣品濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸5 min。取變性蛋白樣品加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣孔中，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，調整電壓為120 V至電泳結束。取出蛋白凝膠，在4℃轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。取出PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗(600倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)反應后，轉移至暗室中，滴加顯色液，曝光后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，分析蛋白表達率。

1.2.5噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 培養至對數生長期轉染后的胃腺癌MKN-45細胞，加入胰蛋白酶消化細胞，離心后用細胞培養液懸浮細胞。調整每毫升細胞懸浮液中含有2×104個細胞，種植于96孔細胞培養板中，每孔加入細胞懸浮液100 μl。放置37℃，5% CO2培養箱中培養48 h后，在細胞中加入體積10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，放在37℃孵育反應4 h。棄上清液，在細胞中加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液。每組設置8個復孔，同時設置空白組，空白組中不加入細胞。觀察結晶物完全融化后，放置于酶標儀上檢測每孔的吸光度(OD值)，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.2.6細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 轉染后胃腺癌MKN-45細胞培養至對數生長期后，加入胰蛋白酶消化細胞，離心后，在細胞沉淀中加入細胞培養液，接種到24孔細胞培養板中，放置37℃，5% CO2培養箱中培養過夜。用移液槍槍頭小心在貼壁細胞中劃出一條細痕，加入PBS洗滌。加入細胞生長液，在37℃，5% CO2培養箱中培養48 h。倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕寬度，計算細胞遷移率，細胞遷移率=遷移的距離/劃痕初始距離。

1.2.7Western印跡檢測細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表達水平 胃腺癌與20 μmol/L Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535作用48 h后，收集細胞，提取細胞蛋白，Western印跡檢測MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平。設置抑制劑FH535作用后的胃腺癌細胞為抑制劑組，同時設置對照組，對照組不加抑制劑。操作步驟同1.2.4。

1.3統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差表示。

2 結 果

2.1Kiss-1在胃腺癌組織中的表達 胃腺癌組織中Kiss-1水平明顯低于癌旁組織，差異顯著(Plt;0.01)。

2.2轉染后細胞中Kiss-1蛋白表達 siRNA control組和p EGFP-N1組細胞中Kiss-1蛋白水平沒有變化。p EGFP-N1-Kiss-1組顯著高于p EGFP-N1組。siRNA Kiss-1組顯著低于siRNA control組(Plt;0.01)。見圖1。

1：p EGFP-N1；2：p EGFP-N1-Kiss-1；3：siRNA control；4：siRNA Kiss-1；下圖同圖1 轉染后胃腺癌細胞中Kiss-1表達水平

2.3Kiss-1對胃腺癌細胞增殖遷移能力的影響 p EGFP-N1-Kiss-1組細胞存活率和遷移率顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。

2.4Western印跡檢測細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平 p EGFP-N1-Kiss-1組細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。見圖2。

2.5抑制Wnt/β-catenin信號通路對胃腺癌細胞增殖遷移能力的影響 抑制劑組細胞存活率和遷移率均顯著低于對照組(Plt;0.01)。抑制劑組細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表達水平顯著低于對照組(Plt;0.01)。見圖3。

與p EGFP-N1組比較：1)Plt;0.01；與siRNA control組比較：2)Plt;0.01圖2 細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表達水平檢測結果

圖3 抑制Wnt/β-catenin信號通路對胃腺癌細胞增殖遷移能力的影響

3 討 論

Kiss-1基因位于1q32染色體上，編碼的Kiss-1蛋白由145個氨基酸組成。有研究表明，Kiss-1在多種腫瘤組織中表達下調甚至缺失。Kiss-1能夠抑制黑色素瘤細胞C8161在大鼠中的轉移能力〔7〕。過表達Kiss-1的乳腺癌細胞株的遷移能力與對照組相比明顯下降〔8〕。近年來研究表明，Kiss-1表達下調與甲狀腺癌、子宮內膜癌等多種癌癥的轉移密切相關〔9〕。本研究收集了50例胃腺癌患者的胃腺癌組織和對應的癌旁組織，qRT-PCR檢測結果發現Kiss-1在胃腺癌組織中表達下調。本研究結果提示，Kiss-1是一種抑癌基因。腫瘤細胞的增殖和遷移在腫瘤的發生發展過程中具有重要作用。腫瘤細胞的遷移受多種基因的復雜調控〔10〕。MMP是目前研究最多的與腫瘤細胞遷移相關的蛋白家族〔11〕。MMP-2和MMP-9在腫瘤的轉移過程中發揮關鍵作用〔12〕。本研究結果提示，Kiss-1可能是通過調控MMP-2和MMP-9作用于胃腺癌細胞。

Wnt/β-catenin信號通路廣泛存在于真核生物體內，屬于高度保守的信號通路〔13〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵效應因子，參與癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移過程〔14〕。C-myc是Wnt/β-catenin信號通路中的一個靶基因，調控癌細胞增殖過程，是一種癌基因〔15〕。FH535是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，能夠特異性阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活〔16〕。本研究結果提示，Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535能夠減弱胃腺癌細胞的增殖和遷移能力。

1Dixon M，Mahar AL，Helyer LK，etal.Prognostic factors in metastatic gastric cancer：results of a population-based，retrospective cohort study in Ontario〔J〕.Gastric Cancer，2016；19(1)：150-9.

2劉愛東，馬 征，熊艷杰，等.胃腺癌中 PYGOPUS2，基質金屬蛋白酶-2 和-14 的表達及對預后的判斷價值〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(12)：2955-7.

3Radhakrishnan P，Ruh N，Harnoss JM，etal.Prolyl hydroxylase 3 attenuates MCL-1-mediated ATP production to suppress the metastatic potential of colorectal cancer cells〔J〕.Cancer Res，2016；76(8)：2219-30.

4Lam K，Pan K，Linnekamp JF，etal.DNA methylation based biomarkers in colorectal cancer：a systematic review〔J〕.Biochim Biophys Acta，2016；1866(1)：106-20.

5Chen S，Chen W，Zhang X，etal.Overexpression of Kiss-1 reduces colorectal cancer cell invasion by downregulating MMP-9 via blocking PI3K/Akt/NF-κB signal pathway〔J〕.In J Oncol，2016；48(4)：1391-8.

6Moya P，Esteban S，Fernandez-Suarez A，etal.Kiss-1 methylation and protein expression patterns contribute to diagnostic and prognostic assessments in tissue specimens for colorectal cancer〔J〕.Tumor Biol，2013；34(1)：471-9.

7Song Y，Duan X，Chen J，etal.The distribution of kisspeptin (Kiss) 1-and Kiss2-Positive neurones and their connections with gonadotrophin-releasing hormone-3 neurones in the zebrafish brain〔J〕.J Neuroendocrinol，2015；27(3)：198-211.

8Yaron M，Renner U，Gilad S，etal.KISS1 receptor is preferentially expressed in clinically non-functioning pituitary tumors〔J〕.Pituitary，2015；18(3)：306-11.

9Chaikhun T，Yanprapasiri C，Sotthibandhu P，etal.Kiss-1 mRNA/kisspeptin distribution in preoptic and arcuate nuclei of cycling buffalo (Bubalus bubalis) hypothalamus〔J〕.Paki Veterin J，2016;36(1)：93-7.

10Dayer C，Stamenkovic I.Recruitment of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) to the fibroblast cell surface by lysyl hydroxylase 3 (LH3) triggers transforming growth factor-β (TGF-β) activation and fibroblast differentiation〔J〕.J Biol Chem，2015;290(22)：13763-78.

11Desmeules P，Trudel D，Turcotte S，etal.Prognostic significance of TIMP-2，MMP-2，and MMP-9 on high-grade serous ovarian carcinoma using digital image analysis〔J〕.Hum Pathol，2015;46(5)：739-45.

12Rodriguez-Calvo R，Ferrán B，Alonso J，etal.NR4A receptors up-regulate the antiproteinase alpha-2 macroglobulin (A2M) and modulate MMP-2 and MMP-9 in vascular smooth muscle cells〔J〕.Thromb Haemost，2015;113(6)：1323-34.

13高 原，于 寧，陳 奇，等.十全大補湯含藥血清對 A549/DDP 細胞株中 Wnt/β-catenin 信號通路蛋白的干預作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2016;22(1)：129-33.

14Hofsteen P，Robitaille AM，Chapman DP，etal.Quantitative proteomics identify DAB2 as a cardiac developmental regulator that inhibits WNT/β-catenin signaling〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2016;113(4)：1002-7.

15Chiacchiera F，Rossi A，Jammula SG，etal.Polycomb complex PRC1 preserves intestinal stem cell identity by sustaining Wnt/β-catenin transcriptional activity〔J〕.Cell Stem Cell，2016;18(1)：91-103.

16Okada K，Naito AT，Higo T，etal.Wnt/β-catenin signaling contributes to skeletal myopathy in heart failure via direct interaction with forkhead box O〔J〕.Circ Heart Fail，2015;8(4)：799-808.

〔2017-02-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R73

A

1005-9202(2017)22-5530-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.019

河北省衛計委青年科技課題(20150642)

1 河北醫科大學第一醫院骨科

李宜炯(1982-)，男，碩士，主治醫師，主要從事骨腫瘤研究。

王 欣(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事臨床腫瘤病理研究。