注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)兔眼外肌的影響

石 晶 譚小波 楊 潔 郝佳穎 李 娜 楊 光

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科,河北 承德 067000)

注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)兔眼外肌的影響

石 晶 譚小波 楊 潔 郝佳穎 李 娜 楊 光

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科,河北 承德 067000)

目的觀察大白兔眼外肌注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)眼外肌的影響。方法將8只大白兔右眼設(shè)為觀察組，左眼設(shè)為對(duì)照組，觀察組眼上直肌注射10 μg NGF；對(duì)照組眼上直肌相同位置注射等量生理鹽水。測(cè)量眼外肌濕重，計(jì)算眼外肌橫截面積，HE染色測(cè)量肌纖維周徑、觀察炎癥情況，免疫組化染色測(cè)定活化衛(wèi)星細(xì)胞。結(jié)果觀察組上直肌橫截面積〔(12.412±1.372)mm2〕顯著大于對(duì)照組〔(6.738±0.856)mm2，Plt;0.05〕。觀察組兔肌纖維周徑〔(228.32±16.57)μm〕顯著大于對(duì)照組〔(129.32±11.16)μm，Plt;0.05〕。觀察組大、中、小細(xì)胞構(gòu)成比分別為27.0%、69.6%、3.5%，對(duì)照組大、中、小細(xì)胞構(gòu)成比分別為13.4%、63.5%、23.2%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。HE染色：治療后2 w，兩組兔眼外肌均沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死，肌纖維邊界清楚、方向一致、排列整齊。免疫組化染色：觀察組活化衛(wèi)星細(xì)胞百分率〔(28.78±4.36)%〕顯著大于對(duì)照組〔(11.87±2.47)%，Plt;0.05〕。結(jié)論眼外肌注射NGF能夠活化衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)眼外肌肌纖維增生，對(duì)眼組織沒(méi)有明顯不良影響。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子；眼外肌；衛(wèi)星細(xì)胞；肌分化因子

斜視是眼科常見(jiàn)疾病，特點(diǎn)為視功能損害和眼球位置失調(diào)，重建雙眼視功能是斜視的治療目標(biāo)。部分斜視患者可以通過(guò)視覺(jué)訓(xùn)練和佩戴眼鏡進(jìn)行治療，但大部分斜視患者需要手術(shù)治療。手術(shù)通過(guò)改變眼外肌長(zhǎng)度或者改變眼外肌附著位置達(dá)到治療的目的，但部分手術(shù)治療患者需要二次手術(shù)或多次手術(shù)治療，具有一定局限性。肉毒桿菌毒素為治療斜視的藥物，具有化學(xué)去神經(jīng)作用，能夠減弱眼外肌肌力，有效治療部分斜視患者，但對(duì)于斜視度數(shù)大者，需要多次注射肉毒桿菌毒素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，增加眼外肌肌力的藥物具有治療斜視的作用，注射胰島素生長(zhǎng)因子等動(dòng)物生長(zhǎng)因子能夠增加眼外肌的肌力〔1〕，在斜視的治療中具有一定作用。神經(jīng)支配因素是斜視發(fā)病的重要原因之一，神經(jīng)支配減弱可引起神經(jīng)生長(zhǎng)因子(EGF)活性降低，斜視的病理學(xué)改變可能和NGF活性下降有關(guān)〔2～5〕。本研究擬探討NGF對(duì)兔眼外肌的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物 8只成年、清潔、健康新西蘭大白兔，購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重2.2～2.7 kg，均無(wú)眼部疾病，無(wú)感染和手術(shù)區(qū)損傷，無(wú)其他疾病。

注射用鼠NGF：武漢海特生物制藥股份有限公司，規(guī)格：20 μg/2 ml/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字S20060051。

1.2建立大白兔實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將8只大白兔麻醉后，選擇右眼為觀察組，左眼為對(duì)照組。觀察組眼在上直肌止點(diǎn)后1 mm肌腹處注入10 μg注射用NGF(10 μg NGF用生理鹽水稀釋為0.1 ml)；對(duì)照組眼在上直肌相同位置注射等量生理鹽水，術(shù)后涂紅霉素眼膏。

1.3取材 術(shù)后2 w處死大白兔，切開(kāi)結(jié)膜囊，暴露并分離上直肌，剪下上直肌，在松弛狀態(tài)下稱量上直肌濕重，并測(cè)量直肌長(zhǎng)度，計(jì)算上直肌橫截面積，上直肌橫截面積=上直肌肌肉濕重/(1.056×上直肌長(zhǎng)度)。

1.4上直肌肌纖維周徑測(cè)量及炎癥情況 將上直肌標(biāo)本用多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下測(cè)量肌纖維的周徑，大細(xì)胞為周徑gt;200 μm，中細(xì)胞為100 μm≤周徑≤200 μm，小細(xì)胞為周徑lt;100 μm，每個(gè)切片測(cè)量150個(gè)肌纖維。觀察上直肌纖維的炎癥情況。

1.5活化衛(wèi)星細(xì)胞測(cè)定 將石蠟包埋的上直肌組織切成5 μm厚的切片，采用免疫組化法測(cè)定肌分化因子的表達(dá)情況，免疫組化染色細(xì)胞核為棕黃色者為肌分化因子陽(yáng)性細(xì)胞，肌分化因子陽(yáng)性位于肌纖維肌膜下的細(xì)胞為活化的衛(wèi)星細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組兔肌肉炎癥情況 HE染色結(jié)果顯示：治療2 w后，兩組兔眼外肌均沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死，肌纖維邊界清楚、方向一致、排列整齊。見(jiàn)圖1。

2.2兩組活化衛(wèi)星細(xì)胞比較 免疫組化染色：觀察組活化衛(wèi)星細(xì)胞百分率〔(28.78±4.36)%〕顯著大于對(duì)照組〔(11.87±2.47)%〕(t=5.264,Plt;0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 兩組兔眼外肌HE染色(×100)

圖2 兩組兔活化衛(wèi)星細(xì)胞免疫組化染色(×400)

2.3兩組兔大中小細(xì)胞比例比較 觀察組大、中、小細(xì)胞構(gòu)成比〔148個(gè)(27.0%)、382個(gè)(69.6%)、19個(gè)(3.5%)〕與對(duì)照組〔分別為82個(gè)(13.4%)、389個(gè)(63.5%)、142個(gè)(23.2%)〕比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=109.780，Plt;0.05)。

2.4兩組兔上直肌橫截面積與眼外肌濕重比較 觀察組上直肌橫截面積〔(12.412±1.372)mm2〕顯著大于對(duì)照組〔(6.738±0.856)mm2〕(Plt;0.05)，兩組眼外肌濕重〔觀察組(0.149±0.021)g，對(duì)照組(0.112±0.023)g〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

2.5兩組兔肌纖維周徑比較 觀察組兔肌纖維周徑〔(228.32±16.57)μm〕顯著大于對(duì)照組〔(129.32±11.16)μm，Plt;0.05〕。

3 討 論

眼外肌力量比較小，平時(shí)處于最佳工作狀態(tài)，眼外肌的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生微小變化對(duì)眼外肌的功能都會(huì)造成影響，眼球正常位置和眼平衡的維持靠眼外肌纖維的緊張度和肌張力。骨骼肌收縮的基本單位是肌小節(jié)，眼外肌纖維的排列紊亂及損傷可導(dǎo)致眼外肌收縮力差，斜視的發(fā)生可能與此有關(guān)。眼外肌的生長(zhǎng)和分化依賴于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的支配，眼外肌的神經(jīng)支配和骨骼肌有所不同，有支配強(qiáng)直纖維的多神經(jīng)和支配顫動(dòng)纖維的單神經(jīng)，眼外肌的神經(jīng)支配和內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)共同決定了眼外肌的運(yùn)動(dòng)〔6〕。眼外肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)需要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的丟失會(huì)引起新陳代謝、生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化〔7〕。胰島素生長(zhǎng)因子為肌肉增加劑，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有增強(qiáng)眼外肌肌力的作用〔8〕。余新平等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)成年兔眼外肌注射胰島素樣生長(zhǎng)因子能夠增加衛(wèi)星細(xì)胞活化，增加肌纖維周徑，增加眼外肌橫截面積，顯著提高兔眼外肌的收縮能力。

NGF是典型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，具有多肽類生物活性，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)作用，并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡都有影響。NGF在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中應(yīng)用廣泛〔10，11〕，骨骼肌受神經(jīng)支配，NGF對(duì)去神經(jīng)支配的骨骼肌修復(fù)和再生具有一定效果〔12，13〕。李廷〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，先天性麻痹性斜視的上斜肌、下斜肌中NGF表達(dá)下降；趙軍波等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉注射液聯(lián)合鼠NGF注射液對(duì)外傷性眼外肌麻痹具有良好的治療效果。眼外肌再生修復(fù)最突出的特點(diǎn)為肌纖維橫截面積和濕重增加，本研究結(jié)果表明注射NGF能夠提高大細(xì)胞比例，增加肌纖維周徑，促進(jìn)眼外肌纖維增生。衛(wèi)星細(xì)胞是肌纖維再生的基礎(chǔ)，激活的衛(wèi)星細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)肌分化因子，本研究也表明NGF可以促進(jìn)眼外肌中衛(wèi)星細(xì)胞活化，促進(jìn)眼外肌纖維再生。

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〔2016-11-19修回〕

(編輯 徐 杰)

R79

A

1005-9202(2017)22-5543-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.024

河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (361008);承德市科技局項(xiàng)目 (201121058)

譚小波(1979-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事眼表疾病研究。

石 晶(1976-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事兒童眼病，斜弱視及眼屈光方面的研究。