頭孢曲松鈉對大鼠腦損傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響

李 萍 李月紅 孟伶俐 周洪霞

(唐山工人醫(yī)院功能檢驗科，河北 唐山 063000)

頭孢曲松鈉對大鼠腦損傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響

李 萍 李月紅 孟伶俐 周洪霞1

(唐山工人醫(yī)院功能檢驗科，河北 唐山 063000)

目的探討頭孢曲松鈉對腦損傷大鼠學習記憶及神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法選用SPF級SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、腦損傷組、治療組。采用液壓沖擊法制備腦損傷模型，治療組于致傷前5 d注射頭孢曲松鈉(200 mg/kg)，連續(xù)5 d。通過Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力，干濕比重法檢測腦組織含水量，免疫組織化學法及Western印跡法檢測caspase-3和caspase-9蛋白表達水平。結(jié)果與腦損傷組比較，治療組明顯增強液壓沖擊性腦損傷的空間學習記憶能力(Plt;0.05)，減輕腦組織含水量(Plt;0.05)，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 和caspase-9蛋白表達(Plt;0.05)。結(jié)論頭孢曲松鈉治療可以通過減輕海馬神經(jīng)細胞凋亡改善大鼠腦損傷后的學習記憶能力。

腦損傷；頭孢曲松鈉；海馬；凋亡；腦水腫

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的具體病理機制目前未完全闡明。研究顯示腦損傷后出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡可能參與TBI的病理生理過程〔1〕。據(jù)報道β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉具有一定的腦保護作用〔2,3〕，但機制未明，且頭孢曲松鈉對大鼠腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響鮮有文獻報道。本研究建立液壓沖擊腦損傷大鼠模型，觀察頭孢曲松鈉對腦損傷大鼠的空間學習記憶能力及海馬caspase-3 和caspase-9蛋白表達變化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雄性SD大鼠72只(體重280～320 g)，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，在標準環(huán)境(12 h黑夜/白天，25℃)飼養(yǎng)7 d，大鼠可以自由獲取食物和水。兔抗大鼠的caspase-3、 caspase-9多克隆抗體及小鼠抗大鼠的β-actin單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。羊抗兔(或鼠)的辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG購自美國Southern Biotech公司。SABC免疫組織化學試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2TBI模型制備及動物分組 72只健康雄性SD大鼠隨機分為：假手術(shù)組，腦損傷組，治療組(n=24)。每組又分為12、24、48及72 h 4個時間點，每時間點6只。模型制備應用腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，采用Dixon法〔4〕制備液壓沖擊腦損傷模型。大鼠出現(xiàn)弓背、豎毛、前肢屈曲、后肢強直、肌張力增高及心率加快等表現(xiàn)表明液壓沖擊性腦損傷大鼠模型制備成功。假手術(shù)組常規(guī)麻醉開顱，但不給予液壓沖擊處理。治療組大鼠在手術(shù)操作前5 d，給予腹腔注射頭孢曲松鈉(200 mg/kg)，并連續(xù)注射5 d。

1.3Morris水迷宮試驗 水迷宮由圓柱形水池和圖像采集處理系統(tǒng)兩部分組成。水池水深25 cm，水溫(25±0.5)℃，將平臺固定于某一象限水面下2 cm。在定位航行試驗中記錄大鼠逃避潛伏期，將大鼠面向池壁分別從4個不同象限入水點放入水池中，記錄大鼠在水池中找到水面下方平臺所需時間。空間探索試驗是在定位航行試驗結(jié)束后，去除隱藏在水面下平臺，然后將大鼠放入水池中，選擇任選入水點，記錄大鼠每分鐘穿越平臺所在象限的次數(shù)，檢測大鼠對原平臺的記憶能力。

1.4腦組織含水量測定 各組行Morris 水迷宮檢測后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭后剝離腦組織，依據(jù)參考文獻〔5〕采用干-濕比重法測定腦組織含水量。

1.5免疫組織化學法檢測 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，用多聚甲醛進行灌流固定后剝離出腦組織，在預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗后，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h。常規(guī)沖水過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片機制作石蠟切片(5 μm)，烤片，水化后進行免疫組織化學染色，按免疫組織化學試劑盒說明書操作。兔抗大鼠的caspase-3多克隆抗體的稀釋濃度為1∶50，兔抗大鼠的caspase-9多克隆抗體的稀釋濃度為1∶100。

1.6Western印跡法檢測caspase-3、-9蛋白 低溫充分裂解腦組織，勻漿后離心留取上清液。依據(jù)文獻〔6〕蛋白變性后上樣(20 μg)進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)進行膜封閉2 h。分別滴加兔抗大鼠的caspase-3、caspase-9多克隆抗體，或小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜。隨后滴加HRP標記IgG室溫孵育2 h。條帶曝光顯色后應用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析，β-actin作為內(nèi)參。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組學習記憶能力比較 與假手術(shù)組相比，腦損傷組傷后各時間點間逃避潛伏期明顯延長，每分鐘穿越平臺的次數(shù)明顯減少(Plt;0.05)，治療組各時間點大鼠與腦損傷組相比，逃避潛伏期明顯縮短，每分鐘穿越平臺的次數(shù)也明顯增多(Plt;0.05)，見表1，表2。

2.2各組腦組織含水量比較 大鼠液壓沖擊致傷后腦組織含水量與假手術(shù)組相比明顯增加(Plt;0.05)。給予頭孢曲松鈉治療后各時間點腦組織含水量顯著減少(Plt;0.05)，見表3。

2.3各組腦組織caspase-3 和caspase-9蛋白免疫組織化學檢測結(jié)果比較 假手術(shù)組大鼠海馬組織caspase-3 和caspase-9陽性細胞較少，呈現(xiàn)弱陽性。腦損傷組海馬組織caspase-3 和caspase-9陽性細胞數(shù)目明顯增多，呈現(xiàn)強陽性，定位于神經(jīng)細胞的胞質(zhì)及胞核中。治療組較腦損傷組caspase-3 和caspase-9 的陽性細胞數(shù)減少，免疫反應性減弱，見圖1，圖2。

表1 各組逃避潛伏期比較

與假手術(shù)組比較：1)Plt;0.05；與腦損傷組比較：2)Plt;0.05，下表同

表2 各組穿越平臺所在象限次數(shù)比較次/min)

表3 各組大鼠腦組織含水量的比較

圖1 各組24 h海馬組織caspase-3免疫組織化學染色結(jié)果(DAB,×400)

圖2 各組24 h海馬組織caspase-9免疫組織化學染色結(jié)果(DAB,×400)

2.4Western印跡檢測各組caspase-3 和caspase-9蛋白表達 假手術(shù)組各時間點caspase-3 和caspase-9蛋白表達量均較低。與假手術(shù)組相比，腦損傷后12 h caspase-3 和caspase-9蛋白表達水平開始升高(Plt;0.05)，于24 h達高峰(Plt;0.05)，隨后逐漸降低。治療組腦損傷各時間點caspase-3 和caspase-9的蛋白表達量均較腦損傷組顯著下降(Plt;0.05)，見表4。

表4 各組海馬組織caspase-3、-9蛋白Western印跡檢測結(jié)果比較

3 討 論

研究顯示腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)細胞死亡中有10%～50%是神經(jīng)細胞凋亡引起的〔7〕。與細胞凋亡密切相關(guān)的caspases分子包括上游起始caspases(caspase-2、8、9和10等)和下游效應caspases(如caspase-3、6和7等)。其中caspase-3在凋亡程序中處于核心位置，是級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，被稱為 “死亡蛋白酶”，是細胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶〔8〕。而caspase-9是一種啟動酶，接受并感知上游凋亡信號，并引起下游效應caspases的級聯(lián)式活化〔9〕。本實驗結(jié)果顯示液壓沖擊性腦損傷后海馬區(qū)神經(jīng)細胞出現(xiàn)明顯凋亡，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的蛋白表達量隨著腦損傷病程時間的延長不斷增加。吳思榮等〔10〕發(fā)現(xiàn)大鼠腦損傷后廣泛存在神經(jīng)細胞凋亡，且持續(xù)時間可達14 d，擴大了急性腦損傷的治療時間窗，凋亡啟動的時程變化與治療時間窗的選擇密切相關(guān)。同時還證實腦損傷中的凋亡除了具有明顯的時序性外，還具有典型的空間分布特征，在腦組織中海馬、齒狀回等區(qū)域為凋亡的易損區(qū)。這種現(xiàn)象可能與損傷程度和受損部位腦組織的敏感性存在差異有關(guān)。

腦損傷中神經(jīng)細胞變性以壞死和凋亡兩種形式共存，其中凋亡遲發(fā)性出現(xiàn)但持續(xù)時間較長。在液壓沖擊的當時，機械性外力直接導致神經(jīng)細胞死亡，而后續(xù)的繼發(fā)性腦損傷(興奮性氨基酸、自由基、鈣離子超載及炎癥反應等)營造的局部不良微環(huán)境通過細胞凋亡誘導神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡〔11〕。神經(jīng)細胞凋亡是液壓腦損傷后遲發(fā)性細胞死亡的主要方式，是腦創(chuàng)傷后神經(jīng)行為學的改變、學習記憶功能障礙的病理基礎(chǔ)，并且與預后密切相關(guān)。

β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉可有效地透過血腦屏障進入腦和脊髓中發(fā)揮相應作用〔12〕。頭孢曲松鈉作為第三代頭孢類抗生素，除了具有抗菌作用外還能夠快速發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔13,14〕。本文結(jié)果顯示，頭孢曲松鈉通過抑制TBT后海馬神經(jīng)細胞凋亡水平，顯著改善大鼠的空間學習和記憶能力，進而發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。

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〔2016-07-19修回〕

(編輯 曹夢園)

R651.1+5

A

1005-9202(2017)22-5555-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.030

唐山市科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃資助項目(12140209A-31)

1 華北理工大學基礎(chǔ)醫(yī)學院

周洪霞(1970-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事腦損傷基礎(chǔ)研究。

李 萍(1978-)，女，碩士，檢驗師，主要從事腦損傷基礎(chǔ)研究。