紅外頻譜照射與超低頻電磁場處理水對D-半乳糖致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型的改善作用

熊愛華 王 欣 呂俊華

(暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

紅外頻譜照射與超低頻電磁場處理水對D-半乳糖致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型的改善作用

熊愛華 王 欣1呂俊華

(暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的探討超低頻電磁場處理水(簡稱頻譜水)對D-半乳糖誘致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其可能機(jī)制。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即正常對照組、模型組(D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1)、石杉堿甲組(0.031 mg·kg-1·d-1)、紅外頻譜照射組和頻譜水組，每組12只。正常組腹腔注射等體積生理鹽水，其余各組大鼠均腹腔注射D-半乳糖6 w誘致學(xué)習(xí)記憶障礙，同時(shí)各組分別灌胃(或飲用)相應(yīng)受試物或紅外頻譜照射，采用穿梭和水迷宮法測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并測定血清、腦組織及海馬體組織的超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH-Px)的活力和丙二醛(MDA)、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)含量的變化。結(jié)果紅外頻譜照射和頻譜水均可改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并提高血清和海馬組織SOD、GSH-Px的活力(Plt;0.05)，降低MDA、AGEs含量(Plt;0.05)。結(jié)論紅外頻譜照射對D-半乳糖誘致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型有明顯的改善學(xué)習(xí)記憶作用，頻譜水對該模型的學(xué)習(xí)記憶有一定的改善作用，其機(jī)制可能與提高機(jī)體和大腦(尤其是海馬組織)的抗氧化能力有關(guān)。

D-半乳糖；學(xué)習(xí)記憶；紅外頻譜照射；電磁場處理水；抗氧化能力

紅外頻譜照射具有抗感染、改善局部血液循環(huán)，提高機(jī)體組織的抗病、抗損傷及促進(jìn)組織修復(fù)等功效。紅外頻譜射線的照射可提高動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶的活力，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物，提高抗氧化能力，從而提示一定強(qiáng)度的紅外頻譜照射，可能會(huì)促進(jìn)腦組織的血液循環(huán)，增加腦組織的供血供氧及減少炎性物質(zhì)的形成，對大腦提供一定的保護(hù)作用。由此對延緩大腦衰老，改善學(xué)習(xí)記憶能力及防治腦神經(jīng)退行性病變有著積極的意義。超低頻電磁場處理水(頻譜水)是將普通飲用水經(jīng)超低頻電磁場處理后，使其物理化學(xué)特性發(fā)生改變的一種特殊處理水〔1〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，頻譜水在提高機(jī)體免疫功能，改善微循環(huán)，改善血液流變學(xué)性質(zhì)，提高抗氧化作用等方面有一定的作用，提示頻譜水可能在多方面、多環(huán)節(jié)對學(xué)習(xí)記憶功能存在有效的干預(yù)作用〔2，3〕。本研究采用D-半乳糖誘致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，通過穿梭實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)方法及氧化和抗氧化等生化指標(biāo)的變化，探討紅外頻譜照射與頻譜水處理對D-半乳糖誘致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于暨南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，飼養(yǎng)鼠料、鋪料均由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，正常飲食，12 h光照，12 h黑暗。

1.2藥品與試劑 頻譜水是由正常飲用水經(jīng)駿豐頻譜水治療保健儀處理后制成；石杉堿甲(雙益平，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，160502)；D-半乳糖(SIGMA公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；還原型谷胱甘肽(GSH-PX)、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)試劑盒均由武漢華美生物技術(shù)公司提供；實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 駿豐頻譜治療保健儀(廣東駿豐頻譜股份有限公司提供，紅外頻譜的波長范圍為3～25 μm)；ZH-CSC型穿梭實(shí)驗(yàn)視屏分析系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；Morris水迷宮(深圳瑞沃德生物科技有限公司)；酶標(biāo)儀(BioTek.USA)；TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KDC-16H高速臺(tái)式離心機(jī)(ZONKIA科大創(chuàng)新科技股份有限公司)；精密移液器(法國吉爾森公司)；玻璃勻漿器(廣州玻璃化學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；ES-2000型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)。

1.4動(dòng)物分組 60只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d后，按體重隨機(jī)分為5組，正常對照組、模型組(D-半乳糖，150 mg·kg-1·d-1)、石杉堿甲組(0.031 mg·kg-1· d-1)、頻譜水組、紅外頻譜照射組，每組12只。

1.5學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠模型的建立及模型處理 除正常對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各組大鼠均連續(xù)腹腔注射D-半乳糖(150 mg·kg-1·d-1)6 w誘致學(xué)習(xí)記憶障礙模型，給藥容積為5 ml/kg體重；在造模的同時(shí)，正常組和模型組大鼠自由飲普通水；石杉堿甲組用蒸餾水配制的石杉堿甲灌胃(灌胃容積為10 ml/kg體重)，自由飲普通水；頻譜水組每天自由飲用頻譜水，不飲普通水；紅外頻譜照射組每天給予紅外頻譜照射(2檔)40 min，自由飲用普通水；動(dòng)物連續(xù)處理共6 w。

1.6行為測定

1.6.1穿梭實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)穿梭箱為50 cm×25 cm×22 cm的長方形暗箱，其分為兩室，中間有檔板隔開，檔板開啟，便以大鼠自由穿梭；兩室頂部均有攝像頭和遠(yuǎn)紅外線，底部均有可通電的銅柵。參數(shù)設(shè)為：循環(huán)次數(shù)(6次)、聲音刺激時(shí)間(7 s)、電刺激時(shí)間(15 s)、循環(huán)間隔(10 s)、電流(1.2 A)、電壓(50 V)。于第30天時(shí)開始每天在模型復(fù)制和給予與組別對應(yīng)的相應(yīng)處理1 h后，開始進(jìn)行大鼠穿梭實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)將大鼠任意放置一側(cè)箱內(nèi)3 min，讓其適應(yīng)環(huán)境，而后開始試驗(yàn)，在聲音刺激7 s后，大鼠所在的實(shí)驗(yàn)箱自動(dòng)通電，以電流刺激大鼠(而不在的那側(cè)實(shí)驗(yàn)箱則無電流)，受電刺激的大鼠可能通過中間開啟的檔板，逃避到另一側(cè)。如此反復(fù)刺激，訓(xùn)練大鼠受電刺激后的反應(yīng)；每遍循環(huán)6次，連續(xù)5 d，將后3 d的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均，作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6.2Morris水迷宮 水迷宮直徑100 cm，高50 cm，靶平臺(tái)直徑8 cm，高20 cm，向水池內(nèi)注入自來水，水面高于靶平臺(tái)1 cm，水中加入適量墨汁，使小鼠看不到平臺(tái)及池底。水池溫度維持20～22℃；攝像頭位于水池正上方，電腦系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)為游泳時(shí)間(60 s)和靶平臺(tái)上停留時(shí)間(10 s)，選擇大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑{(diào)整紅、綠線圓圈使之分別準(zhǔn)確框定水池及平臺(tái)范圍，調(diào)整池面攝像頭，使其視野覆蓋整個(gè)水池，為避免環(huán)境對大鼠的判斷產(chǎn)生干擾，調(diào)整燈光以免水面反射；在水池上方約60 cm處系一紅色標(biāo)志物，以便大鼠定向，室內(nèi)務(wù)必保持安靜。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分：一是定向航行實(shí)驗(yàn)，即設(shè)置靶平臺(tái)；第36天開始，每天在模型復(fù)制和給予與組別對應(yīng)的相應(yīng)處理1 h后開始進(jìn)行大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)按東、西2個(gè)方向入水，大鼠面朝池壁投入水中，記錄大鼠自入水到穩(wěn)定爬上靶平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。大鼠爬上靶平臺(tái)后讓其在上站立10 s，若入水后60 s內(nèi)未能找到靶平臺(tái)并站立10 s，可將動(dòng)物放于靶平臺(tái)上10 s，站立10 s后拿下來，休息30～60 s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練，每遍訓(xùn)練循環(huán)4次，如此訓(xùn)練5 d，于第六天復(fù)制模型和給予與組別對應(yīng)的相應(yīng)處理1 h后開始正式試驗(yàn)，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)以作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。二是空間探索實(shí)驗(yàn)，即撤除靶平臺(tái)，觀察大鼠在一定時(shí)間(60 s)內(nèi)穿越靶平臺(tái)次數(shù)、靶平臺(tái)所在象限運(yùn)行時(shí)間及在水迷宮周邊運(yùn)行時(shí)間。在完成定向航行試驗(yàn)后第2天，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，并記錄作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7生化檢測

1.7.1動(dòng)物血和腦組織采集與處理行為檢測后，繼續(xù)給予D半乳糖和相應(yīng)的處理，第3天處理后1 h腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈取血，收集血清，冷藏靜置2～3 h后3 500 r/min，離心15 min分離血清，分裝，-20℃保存待測。大鼠取血后頸椎脫臼處死，斷顱、剝離顱骨，在冰盤下取出全部腦組織，濾紙吸取多余的血液，分離左右兩側(cè)大腦，將右半大腦留取速凍于-20℃保存；再將左側(cè)大腦皮層小心剝離，取出海馬體組織，將海馬體和剩余大腦組織分別制成10%的組織勻漿，分裝，-20℃保存待測。

1.7.2血清抗氧化能力測定 按試劑盒說明書分別檢測血清GSH-PX、SOD活性和AGEs、MDA的含量。

1.7.3大腦和海馬體組織抗氧化能力測定 取左側(cè)剩余的大腦組織和海馬體組織分別用冰生理鹽水制成10%的組織勻漿，按試劑盒說明書分別測定大腦組織SOD、GSH-Px活力和MDA、AGEs的含量。

1.8統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠穿梭活動(dòng)的影響 D-半乳糖處理30 d時(shí)，與正常對照組比較，模型對照組電擊時(shí)間明顯延長，被動(dòng)逃避次數(shù)明顯減少(Plt;0.05)。而石杉堿甲組和紅外頻譜照射組與模型對照組比較均可明顯降低電擊時(shí)間，增加被動(dòng)逃避次數(shù)(Plt;0.05)，紅外頻譜照射組主動(dòng)逃避次數(shù)增加；頻譜水組可縮短模型動(dòng)物電擊時(shí)間，增加被動(dòng)逃避次數(shù)，而對主動(dòng)逃避次數(shù)沒有影響(Pgt;0.05)。見表1。

2.2紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠水迷宮活動(dòng)的影響 D-半乳糖處理36 d時(shí)，與正常對照組大鼠比較，模型對照組動(dòng)物定向航行潛伏期明顯延長(Plt;0.05)；空間探索實(shí)驗(yàn)中，在原象限停留時(shí)間、靶平臺(tái)穿越次數(shù)明顯減少(Plt;0.05)，繞壁活動(dòng)明顯延長(Plt;0.01)。與模型對照組比較，給予石杉堿甲、頻譜水、紅外頻譜照射處理30 d后，上述各組處理均可明顯縮短定向航行潛伏期，明顯增加在原象限停留時(shí)間、靶平臺(tái)穿越次數(shù)和減少繞壁時(shí)間(Plt;0.05)。見表2。

表1 紅外頻譜照射和飲用頻譜水對模型大鼠穿梭活動(dòng)的影響

與正常組相比：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01；與模型組相比：3)Plt;0.05，4)Plt;0.01；下表同

表2 紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠水迷宮活動(dòng)的影響

2.3紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠血清的影響 與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠血清SOD和GSH-PX活力明顯降低，MDA、AGEs含量明顯增加(Plt;0.05)。與模型對照組比較，給予石杉堿甲處理6 w后，明顯提高血清SOD、GSH-PX活力，降低MDA、AGEs含量(Plt;0.05)；而頻譜水、紅外頻譜照射處理后，對血清SOD和GSH-PX活力影響較小(Pgt;0.05)，但可明顯降低血清MDA的含量(Plt;0.01)；紅外頻譜照射組明顯降低血清AGEs含量(Plt;0.05)，頻譜水對血清AGEs含量有一定的降低作用。見表3。

2.4紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠大腦組織抗氧化能力的影響 與正常對照組大鼠比較，模型對照組大鼠大腦組織SOD活力明顯降低(Plt;0.05)，但MDA和AGEs含量及GSH-PX活力的影響較小(Pgt;0.05)。與模型對照組比較，石杉堿甲組明顯提高大腦組織SOD的活力、降低AGEs含量；頻譜水組明顯提高GSH-PX活力(Plt;0.05)，紅外頻譜照射組對GSH-PX活力有一定的提高作用，兩組均可降低大腦組織中MDA、AGEs的含量，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見表4。

2.5紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠海馬抗氧化能力的影響 與正常對照組大鼠比較，模型對照組大鼠海馬組織SOD和GSH-PX活力明顯降低(Plt;0.05)，MDA和AGEs含量明顯增加(Plt;0.05)。與模型對照組比較，石杉堿甲組、紅外頻譜照射組可明顯提高海馬組織SOD和GSH-PX的活力，明顯降低MDA和AGEs的含量(Plt;0.05)；頻譜水組可明顯提高海馬組織GSH-PX的活力(Plt;0.01)、降低MDA的含量(Plt;0.05)。見表5。

表3 紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠血清抗氧化能力的影響

表4 紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠大腦組織抗氧化能力的影響

表5 紅外頻譜照射和頻譜水處理對模型大鼠海馬抗氧化能力的影響

3 討 論

D-半乳糖屬于醛糖，經(jīng)醛糖還原酶催化還原成半乳糖醇或經(jīng)氧化酶催化氧化成半乳糖醛，進(jìn)一步代謝為CO2和木酮糖，并產(chǎn)生大量O2和H2O2，形成氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞退行性病變，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙和行為活動(dòng)的異常〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖連續(xù)注射誘致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型用于實(shí)驗(yàn)研究，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，體內(nèi)抗氧化能力降低，氧化產(chǎn)物增多，處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)。

新近的研究報(bào)道，大腦神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)與外加的物理干預(yù)手段有一定的關(guān)系，Tsai團(tuán)隊(duì)用特殊頻率的LED燈照射可消除小鼠大腦里的阿爾茨海默病的β淀粉樣蛋白，并認(rèn)為與增強(qiáng)腦內(nèi)γ波活動(dòng)，改善神經(jīng)元之間的連接和傳遞有關(guān)，從而有可能用于防治AD以及改善學(xué)習(xí)記憶障礙〔7〕。而經(jīng)超低頻電磁場處理的頻譜水，其pH發(fā)生堿移，水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)變小，增加水的堿性及跨膜能力。本研究結(jié)果表明，紅外頻譜照射可明顯改善記憶障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為(定向航行潛伏期明顯縮短、增加穿越靶平臺(tái)次數(shù)、延長在原象限運(yùn)行時(shí)間，減少在水迷宮周邊運(yùn)行時(shí)間；穿梭過程中總電擊時(shí)間縮短，電擊次數(shù)減少，被動(dòng)逃避次數(shù)增加)；頻譜水處理對其有一定的改善作用。同時(shí)，紅外頻譜照射和頻譜水處理可明顯增加血清和大腦及海馬組織中抗氧化能力(提高機(jī)體和腦SOD、GSH-PX的活力，降低MDA和AGEs的含量)。

綜上所述，紅外頻譜照射可明顯改善D-半乳糖誘致的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，頻譜水有一定的改善作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體和腦組織的抗氧化能力有關(guān)。

1Shen X.Increased dielectric constant in the water treated by extremely low frequency electromagnetic field and its possible biological implication〔J〕.J Phys，2011；329，012019.

2劉育英，趙秀梅，劉鳳英，等.頻譜水對大鼠白細(xì)胞粘附和微循環(huán)的影響〔J〕.中華實(shí)用醫(yī)藥雜志，2002；2(6)：489-90.

3劉育英，韓 岳，鄭世榮，等.頻譜水對大鼠全血粘度和紅細(xì)胞變形性的影響〔J〕.微循環(huán)學(xué)雜志，2003；13(1)：23-4.

4Ho SC，Liu JH，Wu RY.Establishment of the mimetic aging effect in mice caused by D-galactose〔J〕.Biogerontology，2003;4(1)：15-8.

5Song X，Bao M,Li D，etal.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(1999)：239-51.

6楊 軍，王 靜，姜 文，等.赤芍總苷對D-半乳糖衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶及代謝產(chǎn)物的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2001;17(6)：697-700.

7Iaccarino HF，Singer AC，Martorell AJ，etal.Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia〔J〕.Nature，2016;540(7632)：230-5.

〔2017-02-15修回〕

(編輯 李相軍)

R932；R965

A

1005-9202(2017)22-5559-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.032

廣東駿豐頻譜股份有限公司產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(JF2016-06)

1 廣東駿豐頻譜股份有限公司

呂俊華(1954-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)藥理、心血管藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

熊愛華(1964-)，女，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。