不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內核轉錄因子-κB表達及白細胞介素-2、-10水平的影響

張瑞彪 羅永偉 石秋艷

(河北聯合大學附屬曹妃甸區醫院神經內分泌科，河北 唐山 063200)

不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內核轉錄因子-κB表達及白細胞介素-2、-10水平的影響

張瑞彪 羅永偉1石秋艷2

(河北聯合大學附屬曹妃甸區醫院神經內分泌科，河北 唐山 063200)

目的觀察實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE) 大鼠不同發病階段脊髓內核轉錄因子(NF)-κB表達及血清白細胞介素(IL)-2、IL-10的水平變化及不同劑量阿托伐他汀鈣對其影響。方法以50%豚鼠全脊髓勻漿誘導Wistar大鼠EAE致病模型，采用量化評分法，比較不同劑量阿托伐他汀鈣對 EAE大鼠脊髓中 NF-κB表達及對血清IL-2、IL-10的影響。結果高劑量阿托伐他汀鈣可降低血清IL-2水平，升高IL-10水平，下調NF-κB 在脊髓中的表達(Plt;0.05)，延長EAE大鼠發病的潛伏期，降低EAE大鼠神經功能評分。結論高劑量阿托伐他汀鈣能顯著改善EAE大鼠病情程度及調節血清IL-2、IL-10水平。

阿托伐他汀鈣；自身免疫性腦脊髓炎；核轉錄因子-κB；白細胞介素-2；白細胞介素-10

多發性硬化(MS)是人類中樞神經系統內自身免疫性炎性脫髓鞘性疾病，其主要病理過程表現為自體免疫反應導致的神經軸突損傷及神經纖維髓鞘脫失等〔1〕。本文探討不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠脊髓內核轉錄因子(NF)-κB表達及血清白細胞介素(IL)-2、IL-10水平。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雌性Wistar大鼠58只，6～8 w，體重160～200 g，健康，清潔級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。豚鼠8只，雌雄各半，350～390 g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，健康，清潔級。

1.2模型動物制備方法 我們按照徐玉等〔2〕方法制備豚鼠全脊髓勻漿，予10%水合氯醛4 ml注射于豚鼠腹腔內，麻醉成功后處死，立即冰上剝離脊膜，取出脊髓，按1 g脊髓+1 ml生理鹽水比例配比后，用超聲細胞粉碎儀制成50%全脊髓勻漿，加入等量含4%卡介苗的完全福氏佐劑充分混合至油包水乳劑，乳化后按0.5 ml/只4 h內注射于大鼠四足墊內皮下，誘發建立大鼠EAE模型。

1.3藥物及試劑 阿托伐他汀鈣由大連輝瑞制藥有限公司提供。IL-2、IL-10試劑盒購自上海天呈生物技術有限公司。兔抗大鼠NF-κB 抗體及二步免疫組化檢測試劑盒由北京博奧森生物技術公司提供。完全福氏佐劑由美國 Sigma 公司提供；卡介苗購自北京生物制品研究所。

1.4實驗動物分組 從58只Wistar大鼠中隨機抽取 10只作為正常對照組，其余經過造模成功后隨機分成3組，即EAE組、低劑量組、高劑量組，每組16只，按照時間順序再分成2個亞組，即14 d組和21 d 組，每亞組8只。免疫后當日高劑量組予阿托伐他汀鈣8 mg/kg，于每日清晨8點灌胃治療1次。低劑量組予2.5 mg/kg阿托伐他汀鈣每日清晨8點灌胃治療，每日 1 次。EAE組及正常對照組均于同時間段予溫開水灌胃，直至動物處死。

1.5神經癥狀評分及造模成功標準 大鼠EAE模型評分法采用較為通用的5分評分法：1分：大鼠尾巴無力下垂；2分：雙后肢輕度無力；3分：嚴重后肢麻痹；4分：四肢癱瘓；5分：瀕死狀態或死亡。造模成功標準：神經癥狀評分≥1分。

1.6病理標本制作 各組大鼠造模成功及相應治療后第14、21天分別處死。10%水合氯醛5 ml腹腔注射，麻醉成功后斷頭處死，迅速完整剝離脊髓，石蠟封片包埋，按照每25 μm 間斷性連續切片后行常規HE染色。

1.7血清IL-2、IL-10及NF-κB陽性細胞的測定 大鼠處死后立即采心血2 ml，3 000 r/min離心后獲取血清，-70℃冰箱保存。血清IL-2、IL-10的測定采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法。試劑盒購自上海天呈生物技術有限公司，由實驗室工作人員嚴格按照試劑盒說明進行測定。NF-κB陽性細胞采用免疫組化法檢測，由實驗室專業人員嚴格按照試劑盒說明操作，同時設陰性對照。取大鼠脊髓切片在顯微鏡下計數每張片內隨機5個高倍視野(×400)NF-κB陽性細胞數，NF-κB的表達以該片陽性細胞數總和/5表示，取10片平均值作統計學處理。

1.8統計學方法 采用SPSS14.0軟件進行χ2及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組神經癥狀評分及死亡情況 正常對照組大鼠各時間段均無發病及死亡情況發生。其余各組7～13 d發病，部分大鼠癥狀呈進展性加重，少數病情緩解后復發，部分大鼠死亡。高劑量組病情明顯輕于低劑量組及EAE組，同日神經功能評分明顯低于上述兩組，發病率及死亡率亦明顯低于上述兩組，見表1。

2.2各組血清炎癥因子及NF-κB 標記的陽性細胞 發病后14 d EAE組血清IL-2水平明顯高于正常對照組，發病21 d較14 d時有所降低，其中兩個時間段高劑量組均低于低劑量組及EAE組，而IL-10則呈反方向變化，EAE組及低劑量組發病14～21 d均低于正常對照組，而高劑量組則明顯升高，高于上述三組。NF-κB 陽性細胞數量于14 d后明顯增多，到21 d陽性細胞數又逐漸減少，兩個時間段均高于正常對照組(Plt;0.05)。高劑量組大鼠在免疫后14、21 d，NF-κB 陽性細胞數明顯低于EAE組及低劑量組(Plt;0.05)。見表2。

表1 各組EAE發病情況及病情評分

與正常對照組比較：1)Plt;0.05；與EAE組及低劑量組比較：2)Plt;0.05，下表同

表2 各組不同時間段血清炎癥因子水平及NF-κB表達情況

3 討 論

MS是一種自身免疫性炎性脫髓鞘性疾病，多種細胞因子及自由基在其疾病發展過程中起著重要作用，有研究報道，自由基清除劑依達拉奉能有效緩解MS癥狀〔3〕。研究發現CD4+Th1細胞在EAE發病過程中起到了主要的介導作用〔4〕。CD4+細胞分為Th1和Th2兩個亞型。兩個亞型分別分泌不同炎癥因子，在整個炎癥反應中扮演不同角色。Th1型細胞因子如IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，能激活巨噬細胞，介導炎癥反應的發生及進展，導致并促進神經髓鞘的損傷，對神經系統脫髓鞘病變的產生起著極為重要作用；Th2型細胞介導的細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10等，可以抑制Th1型細胞因子，并通過下調血管內皮細胞和巨噬細胞的應急狀態參與炎癥反應的修復，對神經纖維脫髓鞘起到保護作用〔5〕。因此，Th1/Th2之間的動態平衡是機體免疫平衡、自身防御、內環境穩定的重要機制。已有研究表明MS患者及EAE模型中存在Th1/Th2型細胞因子的失衡，維持Th1/Th2型細胞因子的動態平衡已成為研究MS發病及臨床轉歸的新策略之一，同時NF-κB通路是參與上述炎癥因子調控的重要信號系統，在EAE免疫調節和炎癥發展中具有重要作用〔6〕。他汀類藥物是目前臨床的最常用的一類調脂藥物，而阿托伐他汀作為最有效的他汀類調脂藥物之一，不僅可以穩定動脈硬化斑塊，且可有效地降低血超敏C反應蛋白等炎癥因子〔7〕。他汀類藥可以減少白細胞向中樞神經系統的移動，同時調節T細胞和B細胞的趨化因子和黏附因子，減少誘導T細胞激活的黏附分子的表達，下調T細胞和 B細胞趨化因子的受體〔8〕，其抗炎癥機制可能是通過抑制EAE大鼠Th1細胞，阻斷類異戊二烯中間代謝產物的生成，進而減少干擾素(IFN)和TNF-α的水平，從而維持Th1/Th2的動態平衡〔9〕。王淑歌等〔10〕研究顯示阿托伐他汀可對EAE大鼠產生影響。

本實驗提示高劑量阿托伐他汀鈣具有免疫雙向調節作用，可能通過抑制NF-κB 陽性細胞增殖活化過程，從而減輕神經系統內炎癥反應，因此利于EAE的恢復。林述凱等〔11，12〕也有研究證明，阿托伐他汀可促進中樞神經系統內的星形膠質細胞的增生，從而生成多種抗炎癥因子，這些抗炎癥因子能有效減低神經髓鞘的損傷，可有效減輕發病癥狀，有利于 EAE 的恢復。

1郝海光，李紅艷，張曉丹，等.獨活治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的免疫學機制研究〔J〕.時珍國醫國藥，2012；23(10)：2407-10.

2徐 玉，劉瑞春，王 穎，等.Wistar大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立〔J〕.腦與神經疾病雜志，2007；15(6)：415-8.

3梁江紅，陳 琳.依達拉奉對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的保護作用〔J〕.現代診斷與治療,2012；23(8)：1116-7.

4朱振國，王新施，陳艷艷，等.3種大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的差異〔J〕.醫學研究雜志，2013；42(2)：34-7.

5厲 芳，鄭榮遠，張正學，等.阿米洛利對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經系統中細胞因子表達的影響〔J〕.中國臨床神經科學，2012；20(2)：121-5.

6侯紹蔚，劉岳婷，郭敏芳.鹽酸法舒地爾治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的潛能與抗炎作用〔J〕.中國臨床神經科學，2012；29(2)：126-34.

7劉 威，呂 娟，劉榮麗，等.阿托伐他汀對腦梗死并發頸動脈粥樣硬化斑塊及C反應蛋白的影響〔J〕.中國實用神經疾病雜志，2014；17(12)：42-3.

8田廣平，石秋艷，王淑歌.阿托伐他汀對EAE大鼠脊髓ICAM-1和TGF-β1表達的影響〔J〕.中華神經醫學雜志，2011；10(10)：979-82.

9Mizrachi K，Aricha R，Feferman T，etal.Involvement of phosphodiesterases in autoimmune diseases〔J〕.J Neuroimmunol，2010；220(1-2)：43-51.

10王淑歌，林述凱，石秋艷，等.阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的影響〔J〕.安徽醫科大學學報，2011；46(10)：997-1000.

11林述凱，石秋艷，王淑歌，等.阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內NF-κB表達的影響〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2011；37(4)：607-11.

12石秋艷，張瑞彪，田廣平.不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內NF-κB表達及血清炎性因子的影響〔J〕.疑難病雜志，2014；13(1)：70-3.

〔2016-08-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R744.3

A

1005-9202(2017)22-5562-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.033

1 河北聯合大學附屬醫院病案室 2 河北聯合大學神經重癥科

張瑞彪(1973-)，男，主治醫師，醫學碩士，主要從事慢性炎癥反應與神經內科疾病相關性研究。