白細(xì)胞介素-8基因在鼻息肉組織中的表達(dá)及對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響

鄭慧媛 馬新春 石 磊 李建民

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，青海 西寧 810001)

白細(xì)胞介素-8基因在鼻息肉組織中的表達(dá)及對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響

鄭慧媛 馬新春 石 磊 李建民

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，青海 西寧 810001)

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-8基因在鼻息肉組織中的表達(dá)及對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法Western印跡檢測(cè)IL-8在鼻息肉組織及下鼻甲組織中的表達(dá)；從鼻息肉組織中分離培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細(xì)胞(HNEC)，將IL-8小干擾RNA(IL-8-siRNA)和陰性對(duì)照(siRNA-NC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組，Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果；各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，Western印跡檢測(cè)酶切caspase3蛋白表達(dá)。結(jié)果IL-8在鼻息肉組織中的表達(dá)顯著高于下鼻甲組織(Plt;0.01)；siRNA-NC組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組顯著低于對(duì)照組(Plt;0.01)；siRNA-NC組細(xì)胞凋亡率及酶切caspase3蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組均顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)。結(jié)論IL-8在鼻息肉組織中高表達(dá)，沉默IL-8的表達(dá)能通過上調(diào)酶切caspase3蛋白表達(dá)促進(jìn)HNEC凋亡。

白細(xì)胞介素-8基因；鼻息肉；鼻黏膜上皮細(xì)胞；凋亡

目前鼻息肉發(fā)病原因及機(jī)制尚不清楚〔1〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子參與了鼻息肉的發(fā)生發(fā)展〔2〕。白細(xì)胞介素(IL)-8是一種多源性細(xì)胞因子，在炎癥和腫瘤中可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞。IL-8的激活可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡〔1〕。IL-8基因在鼻息肉形成中的作用目前研究尚不清楚。本研究旨在探討IL-8在鼻息肉組織中的表達(dá)及其對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般材料 收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院2014年6月至2015年7月手術(shù)切除后存檔的慢性鼻竇炎鼻息肉組織石蠟包埋標(biāo)本40例，其中男27例，女13例，年齡20～71歲，中位年齡45.1歲?；颊呔鶠槭状伪窍⑷庹g(shù)，且在術(shù)前2 w未使用多抗組胺類藥物、糖皮質(zhì)激素。對(duì)照組選擇同時(shí)期在我院進(jìn)行鼻中隔矯正術(shù)患者的下鼻甲組織，其中男16例，女12例，年齡21～51歲，中位年齡34.2歲。所有樣品采集均經(jīng)過患者及家屬的知情同意。試劑和儀器：胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天；IL-8、酶切caspase3單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購(gòu)于美國(guó) Abcam；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自ACTGene公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Labsystems公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SIM公司。

1.2方法

1.2.1IL-8在鼻息肉組織中的表達(dá)檢測(cè) 將鼻息肉組織及下鼻甲組織放入研缽研磨成粉末后，加入適量的裂解液置于冰上反應(yīng)30 min，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。按照BCA試劑盒操作說明檢測(cè)提取的蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，100℃變性5 min，將變性蛋白加入到制好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠，每孔加入25 μl，電泳結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%的脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，以IL-8單克隆抗體作為一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，37℃孵育2 h。TBST清洗后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.2人鼻黏膜上皮細(xì)胞(HNEC)的分離培養(yǎng) 取鼻息肉組織，用4℃的PBS多次沖洗后，加入0.25%的胰酶消化16～18 h，制成細(xì)胞懸液。錐蟲藍(lán)染色法確定細(xì)胞的活性后，將細(xì)胞懸液稀釋為每升含有108個(gè)細(xì)胞，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，去除成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(已加入蓋玻片)，加入含有5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 mg/L胰島素、10 μg/L霍亂霉素、0.36 mg/L氫化可的松、100 μg/L維生素A酸，20 μg/L三碘甲狀腺氨酸、25 μg/L表皮生長(zhǎng)因子、3.75 mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DMEM/F12培養(yǎng)基，隔天換液1次，進(jìn)行無血清原代培養(yǎng)4～5 d。細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上進(jìn)行消化傳代。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HNEC，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加2 ml細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)24 h。將對(duì)照組(空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組)、siRNA-NC(轉(zhuǎn)染100 nmol/L的陽(yáng)性siRNA)、IL-8-siRNA(轉(zhuǎn)染100 nmol/L的IL-8-siRNA)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，室溫放置15 min后，取500 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞中，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染后的上述3組細(xì)胞，以3×104個(gè)/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取1 ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃，1 000 r/min離心8 min，棄上清，加入提前預(yù)冷的PBS 3次洗滌細(xì)胞后，在細(xì)胞沉淀中加入200 μl緩沖液，加入 PI和 Annexin-V各5 μl，充分混勻后放置避光條件下反應(yīng)20 min，加400 μl緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測(cè)酶切caspase3蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的1.2.3中的3組細(xì)胞，適量的Trizol置于冰上裂解反應(yīng)30 min后，4℃，12 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清液，BCA試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。按照1.2.1檢測(cè)酶切caspase3蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IL-8在鼻息肉組織中的表達(dá) IL-8在鼻息肉組織中的表達(dá)(0.468±0.035)顯著高于下鼻甲組織(0.162±0.023，Plt;0.01)。見圖1。

2.2IL-8在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá) siRNA-NC組細(xì)胞中IL-8蛋白表達(dá)(0.606±0.035)與對(duì)照組(0.611±0.039)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組(0.224±0.023)顯著低于對(duì)照組(Plt;0.01)。見圖2。

2.3IL-8對(duì)HNEC凋亡的影響 siRNA-NC組細(xì)胞凋亡率〔(2.28±0.92)%〕及酶切caspase3蛋白表達(dá)(0.092±0.009)與對(duì)照組〔(2.23±0.77)%，0.108±0.010〕比較差異不顯著(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組細(xì)胞凋亡率〔(15.12±1.43)%〕及酶切caspase3蛋白表達(dá)(0.311±0.029)顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)，見圖3。

圖1 IL-8在鼻息肉組織及下鼻甲組織中的表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中 IL-8蛋白表達(dá)水平

圖3 IL-8對(duì)HNEC凋亡的影響

3 討 論

鼻息肉的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，手術(shù)治療效果雖然有所提高，但病人術(shù)后仍有復(fù)發(fā)。目前研究認(rèn)為鼻息肉的形成是由多種因素共同參與的慢性炎癥〔2〕。且有研究顯示，多種細(xì)胞因子影響了鼻息肉的發(fā)生及病理過程〔3〕。IL-8是一種炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞遷移到炎癥或感染部位，在損傷、感染患者的血清中可發(fā)現(xiàn)IL-8的高表達(dá)〔4〕。研究顯示，在鼻息肉勻漿組織中檢測(cè)到IL-8的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，在慢性鼻竇炎患者的竇黏膜也可檢測(cè)IL-8的高表達(dá)〔5〕。本研究中也檢測(cè)IL-8在鼻息肉組織中的高表達(dá)，其結(jié)果與前人的研究一致。RNA干擾是由雙鏈DNA引起的一種序列特異性的基因沉默，作為下調(diào)基因的工具已被廣泛用于基因功能的研究及疾病的治療〔6〕。本研究結(jié)果顯示，沉默IL-8的表達(dá)能促進(jìn)HNEC的凋亡及酶切caspase3蛋白的表達(dá)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在受到各種刺激因素后所發(fā)生的程序性死亡過程，其過程受到多種基因的調(diào)控。其中以caspase家族及Bcl-2家族為主。caspase3位于caspase所介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，通常以非活化的酶原形式在細(xì)胞質(zhì)中存在，其激活后可降解多種蛋白質(zhì)底物，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡〔7〕。本研究結(jié)果說明沉默IL-8的表達(dá)通過上調(diào)酶切caspase3蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)HNEC的凋亡。

1Visciano C，Liotti F，Prevete N，etal.Mast cells induce epithelial-to-mesenchymal transition and stem cell features in human thyroid cancer cells through an IL-8-Akt-Slug pathway〔J〕.Oncogene，2015；34(40)：5175-86.

2王成碩，婁鴻飛，孟一帆，等.組織普酸粒細(xì)胞增多對(duì)慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉復(fù)義的預(yù)測(cè)價(jià)值研究〔J〕.中華耳鼻咽喉頭顱外科雜志，2016；51(4)：268-72.

3Wang LF，Chien CY，Tai CF，etal.Vitamin D decreases the secretion of eotaxin and RANTES in nasal polyp fibroblasts derived from Taiwanese patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps〔J〕.Kaohs J Med Sci，2015；31(2)：63-9.

4Beigelman A，Isaacson-Schmid M，Sajol G，etal.Randomized trial to evaluate azithromycin′s effects on serum and upper airway IL-8 levels and recurrent wheezing in infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2015；135(5)：1171-8.

5Okano M，F(xiàn)ujiwara T，Kariya S，etal.Regulatory effect of TLR3 signaling on staphylococcal enterotoxin-induced IL-5，IL-13，IL-17A and IFN-γ production in chronic rhinosinusitis with nasal polyps〔J〕.Allergol Int，2016；65(1)：96-102.

6王 婷，高玉珍，沈明志，等.條件性 RNA 干擾技術(shù)研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015；15(3)：547-50.

7林 歡，冷吉燕，于 靜，等.藍(lán)莓花色苷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡調(diào)控基因 Bax，Caspase-3 表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2015；35(15)：4157-8.

〔2017-04-15修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R765.2

A

1005-9202(2017)22-5564-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.034

鄭慧媛(1975-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事鼻腔鼻竇腫瘤研究。