肝細胞癌患者IL-22及CyclinD1表達的變化及意義

馬 躍 朱春雷

(北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132011)

肝細胞癌患者IL-22及CyclinD1表達的變化及意義

馬 躍 朱春雷

(北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132011)

目的探討原發性肝癌患者外周血中白細胞介素(IL)-22及細胞周期蛋白(Cyclin)D1的表達情況。方法結果與對照組相比，肝細胞癌組外周血血清中 IL-22及CyclinD1水平明顯升高(Plt;0.01)；100 ng/ml IL-22可刺激肝細胞癌細胞低分泌CyclinD1蛋白，組間比較有統計學差異(Plt;0.05)。結論在原發性肝癌發病及惡化中的一個重要因素是IL-22對CyclinD1分泌的影響作用，但具體機制尚待進一步研究，同時IL-22是否可以作為新型藥物應用也尚待進一步研究。

原發性肝癌；白細胞介素-22；細胞周期蛋白D1

目前原發性肝癌的病因病機尚不明確，該病多發于男性患者，病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉毒素等多種因素可能與此疾病有關〔1〕。肝癌在臨床上發病特征不明顯，尤其缺乏早期典型癥狀，待疾病特征明顯時多已屬中晚期。有報道顯示多種疾病的病理過程中均有輔助T細胞(Th)22參與其中，主要影響患者的自身免疫性和炎癥疾病的病理機制，進而導致體內主要細胞因子白細胞介素(IL)-22的分泌表達增加〔2～4〕，對肝癌、酒精性肝損傷、急性肝炎等肝臟疾病具有重要的免疫調節作用，還能調節疾病的發生和預后〔5，6〕。細胞周期蛋白(Cyclin)D1是原癌基因的一種，其過度表達會使細胞增殖失控甚至惡性化。CyclinD1 的基因過度表達和擴增在多種腫瘤中均有所發現。本研究旨在探討肝細胞癌患者細胞內及外周血中IL-22和CyclinD1的變化及意義。

1 材料和方法

1.1材料 選擇2013～2015年來北華大學附屬醫院診斷為原發性肝癌的患者，入院前3個月內和術前患者均未進行放化療、抗乙肝病毒(HBV)治療、介入治療和免疫抑制劑治療。對照組：健康體檢人員的外周血。

1.2方法

1.2.1細胞培養 取原發癌或組織標本適量，標本取出后立即在無菌條件下置于含有青霉素、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗，剔除非腫瘤及壞死組織，胚胎組織需用彎頭剪盡量剪碎(組織塊體積lt;1 mm3)。用Hanks液洗滌2～3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液，向裝有組織塊的三角燒瓶中加入20 ml左右的胰蛋白酶(0.125%)，再用磁力攪拌于37℃下反應20 min左右，加入適量血清終止反應，在經無菌紗布過濾之后，以800 r/min將濾液離心5～10 min后收集細胞，最后棄去上清液，將帶有雙抗的RPMI1640或DMEM培養基加入培養瓶中繼續培養。

1.2.2酶聯免疫吸附法(ELISA) 核對所需實驗試劑，逐步溶解到室溫，將標準品和標本稀釋液分別加在標準孔、空白孔中，將已稀釋好的血清及細胞培養基樣本加入測孔中，用封板膠紙封住反應孔，于37℃孵育箱中培養1.5 h；提前20 min左右配制生物素化抗體工作液，甩干孔內液體后用達標紙處理表面液體；洗板液洗板(除空白孔外)，每次1 min，共3次，另外每孔加100 μl生物素化抗體工作液，再用封板膜封好，于37℃孵育箱中培養1 h；以室溫避光條件保存提前配制的酶結合物工作液，棄置孔板液體，再用洗板液洗板，每次1 min，共3次；再依次加入配制好的辣根過氧化物酶用以標記親和素工作液，每孔100 μl，37℃避光孵育30 min；棄置孔板液體，洗板5次，每次1 min，每孔加入100 μl顯色液，于37℃孵育箱中避光培養20 min；每孔加入終止液100 μl，混勻并打開酶標儀，在450 nm波長范圍內測量每孔光密度(OD)值。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0進行t檢驗、秩和檢驗。

2 結 果

2.1兩組血清 IL-22及CyclinD1水平比較 相對于對照組，肝癌組血清中IL-22及CyclinD1水平顯著升高(Plt;0.01)。見表1。

表1 兩組外周血IL-22及CyclinD1表達情況比較

與對照組比較:1)Plt;0.01

2.2肝癌組IL-22對CyclinD1分泌的作用 100 ng/ml濃度的IL-22可刺激肝細胞癌細胞低分泌CyclinD1蛋白，組間比較差異有統計學意義(F=160.47，Plt;0.05)，其中0 ng/ml IL-22組CyclinD1水平為(10.48±3.92)pg/ml，20 ng/ml IL-22組為(5.31±1.69)pg/ml，50 ng/ml IL-22組為(6.43±2.26)pg/ml，80 ng/ml IL-22組為(4.12±0.82)pg/ml，100 ng/ml IL-22組為(2.47±0.83)pg/ml，200 ng/ml IL-22組為(3.87±0.28)pg/ml。

3 討 論

原發性肝癌的病因病機尚未明確，目前認為其主要影響因素包括肝硬化、病毒性肝炎、遺傳因素、飲用水污染、黃曲霉毒素等。從我國的基本情況來看，該病主要在肝炎肝硬化的基礎上發生，故該病在發生發展過程中與免疫細胞及炎癥因子之間有著密切的關系。早期有研究表明IL-22屬于Th1 型細胞因子，但隨著新型 Th 細胞亞群Th17日益被發現，漸漸發現IL-22不僅可作為Th17的細胞效應因子，還被認為是其主要來源〔7〕。Duhen 等〔8〕發現一種新型Th22細胞，該細胞被認為是IL-22的主要來源，目前研究發現Th22和IL-22涉及了多種疾病。因為 Th22細胞通過分泌相關細胞因子作用于機體，最終參與生物學作用并通過細胞因子啟動而引起細胞信號轉導，本研究基于此對在外周血血清中表達的由Th22 細胞分泌的主要效應因子進行了進一步的檢測。

IL-22是IL-10的細胞因子家族的成員，通過Ⅱ類細胞因子受體的異源二聚體IL-22R/IL-10R2進行信號傳導，這種受體在多種上皮組織中都有表達。有研究表明〔9〕，在多種炎癥疾病(如自身免疫性疾病、感染性疾病等)中IL-22的表達量升高，其在上述疾病中均參與了炎癥反應。據報道，IL-22對細胞增殖、分化和凋亡的調節具有重要作用，對于腫瘤細胞而言，IL-22可調節使其細胞周期停滯在G2/M期，從而對腫瘤增殖起到抑制作用〔10〕。在慢性肝損傷中，Th22 細胞還可通過分泌IL-22效應因子起到緩解肝損傷的作用，因此IL-22的表達增多可使受損肝細胞繼續存活甚至有可能惡化為肝癌〔11〕，由此可見，在原發性肝癌的發病及惡化過程中，Th22細胞及其分泌的IL-22均可能起到重要的作用。

在腫瘤的不協調增殖中，研究者發現了調控細胞周期的相關蛋白，同時認為細胞周期調控失常與腫瘤密切相關。作為一種細胞周期調節因子CyclinD1的過度表達被認為是多種原發性腫瘤的病理學特征，對腫瘤診斷和預后判斷的意義重大。CyclinD1呈周期性變化，是一種弱致癌基因。CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)和(或)CDK6結合成復合體進而激活CDK，從而促進細胞G1/S期轉化并促進腫瘤的發生〔12〕。關于CyclinD1的過度表達導致癌變的研究較多，醫學上也曾設想將CyclinD1異常表達作為癌癥診斷的指標之一，進而研究細胞周期調控中CyclinD1的臨床作用，從而借以研發癌癥治療藥物。本實驗進一步提示IL-22原發性肝癌的發病惡化中是通過影響CyclinD1的分泌而起到調控作用，但具體機制尚待進一步研究，而且1L-22是否可以作為新型藥物應用也尚待進一步研究。

1陸再英，鐘南山，謝 毅.內科學〔M〕.第7版.北京：人民衛生出版社，2008：457-62.

2Zheng Y，Valdez PA，Danilenko DM，etal.Interleukin-22 mediates early host defense against attaching and effacing bacterial pathogens〔J〕.Nat Med，2008；14：282-9.

3Aujla SJ，Chan YR，Zheng M，etal.IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia〔J〕.Nat Med，2008；14：275-81.

4Wolk K，Witte E，Wallace E，etal.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense，cellular differentiation，and mobility in keratinocytes：a potential role in psoriasis〔J〕.Eur J Immunol，2006；36：1309-23.

5Jiang R，Tan Z，Deng L，etal.Interleukin-22 promotes human hepatocellular carcinoma by activation of STAT3〔J〕.Hepatology，2011；54(3)：900-9.

6Ki SH，Park O，Zheng M，etal.Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding：role of signal transducer and activator of transcription 3〔J〕.Hepatology，2010；52(4)：1291-300.

7Zheng Y，Danlienko DM，Valdez P，etal.Interleukin-22，a T(H) 17 cytokine，mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis〔J〕.Nature，2007;445 (7128)：648-51.

8Duhen T，Geiger R，Jarrossay D，etal.Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells〔J〕.Nat Immunol，2009;10(8)：857-63.

9Ma HL，Liang S，Li J，etal.IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation〔J〕.J Clin Invest,2008；118：597-607.

10Wolk K，Kunz S，Witte E，etal.IL-22 increases the innate immunity of tissues〔J〕.Immunity，2004;21：241-54.

11Zenewicz LA，Yancopoulos GD，Valenzuela DM，etal.Interleukin-22 but not interleukin-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation 〔J〕.Immunity，2007;27(4)：647-59.

12Liu B，Ren Z，Shi Y，etal.Activation of signal transducers and activators of transcription 3 and overexpression of its target gene CyclinD1 in laryngeal carcinomas〔J〕.Laryngoscope,2008；18：1976-80.

〔2017-05-11修回〕

(編輯 郭 菁)

R73

A

1005-9202(2017)22-5616-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.059

吉林省教育廳“十三五”科學技術項目(No.JJKH20170055K)；吉林市科學技術局基金項目(No.201536068)

朱春雷(1977-)，男，博士，副主任醫師，主要從事肝膽疾病免疫研究。

馬 躍(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事肝膽疾病免疫研究。