響應面試驗優化QuEChERS法提取雞蛋中雜色曲霉毒素工藝及方法學驗證

周 健，許嬌嬌*，金米聰，蔡增軒，黃百芬，任一平

響應面試驗優化QuEChERS法提取雞蛋中雜色曲霉毒素工藝及方法學驗證

周 健1,2，許嬌嬌1,*，金米聰2，蔡增軒1，黃百芬1，任一平3

（1.浙江省疾病預防控制中心理化毒理所，浙江 杭州 310051；2.寧波市疾病預防控制中心，浙江省微量有毒化學物健康風險評估技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315010；3.國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心，浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006）

使用乙腈溶液對雞蛋中雜色曲霉毒素進行提取，后加入無水Na2SO4、NaCl和無水CH3COONa進行鹽析，取出上層乙腈后加入C18吸附劑和無水Na2SO4進行凈化濃縮后上機檢測。采用Plackett-Burman試驗、單因素試驗和響應面法優化，最大限度地提高雜色曲霉毒素的提取率。使用基質匹配曲線外標法定量，所有陽性樣品均使用免疫親和柱法復測。結果表明，雜色曲霉毒素在0.125～1 000 ng/mL質量濃度范圍內線性良好，相關系數達0.999 6，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。在空白雞蛋基質中進行三水平加標實驗，測得提取率在86.8%～90.4%范圍內，日間重復性在1.5%～6.2%范圍內。最終，將建立的方法用于45 份樣品檢測，其中10 份雞蛋樣品檢測結果呈陽性，含量為0.5～3 608 μg/kg。

雞蛋；雜色曲霉毒素；QuEChERS法；響應面法；超高效液相色譜-質譜聯用

雞蛋是人類最重要的動物源性食物之一，富含蛋白質、膽固醇及礦物質等營養成分，有利于促進人體生長、預防疾病、改善健康狀況等，并且常常被加工成其他各類食品。近幾年隨著社會經濟的發展，生活質量的提高，食品中有毒有害物質尤其是真菌毒素污染已成為政府重視、社會關注、世界矚目的熱點問題[1-3]。為保障食品安全，降低人群攝入真菌毒素的風險，各國對食品（主要針對谷物及其衍生產品）中部分真菌毒素規定了相應的殘留限量標準，但鮮有研究調查雞蛋中真菌毒素的污染水平[4-6]，而對雞蛋中雜色曲霉毒素（sterigmatocystin，STC）的檢測報道更是少之又少。

STC主要由雜色曲霉（Aspergillus versicofor）、構巢曲霉（A. nidulans）、黃曲霉（A. flavus）和皺曲霉（A.rugulosus）等產毒真菌代謝生成，廣泛分布于自然界中，可污染大米、小麥、玉米、豆類、花生餅及飼料[7-8]。被污染的糧食及飼草被動物攝入后，會通過食物鏈進入人類體內，從而對人體健康造成損害[9-10]。STC是第一個被發現含有雙氫呋喃苯并呋喃體系的天然產物，其結構與黃曲霉毒素B1十分相似，兩者結構式如圖1所示。通過14C同位素標記法已證實，STC可以轉變為黃曲霉素B1，其毒性在目前已知的真菌毒素中僅次于黃曲霉素B1，致癌能力約為黃曲霉素B1的1/10，此外，STC還具有腎、肝毒性，會導致動物肝硬變、中毒性肝炎、肝細胞和腎小管上皮細胞壞死等[11]。

圖1 STC（A）和黃曲霉毒素B1（B）化學結構式Fig. 1 Chemical structures of sterigmatocystin (A) and aflatoxin B1 (B)

對食品中真菌毒素測定的預處理過程主要包括提取和凈化2 個步驟，而食品基質通常成分復雜，因此凈化步驟成為分析實驗關鍵步驟[12]。目前真菌毒素的主要凈化方法是在固相萃取法基礎上衍生的免疫親和柱法[12-14]和多功能柱法[15-17]，前者雖然凈化效果較好，但存在成本過高、耗時長、無法同時測定多組分等缺陷；后者處理樣品速度快，適用范圍廣，但凈化效果有限，部分待測毒素的絕對提取率較低。除固相萃取法外，QuEChERS法因其快速、簡單、廉價、高效、穩定、安全、樣品通量高等特點，近年來被廣泛應用于真菌毒素檢測[18-20]，但QuEChERS法凈化過程往往涉及到較多可變的實驗條件，如果采用傳統的單因素試驗法則耗時耗力，且無法對條件間相互作用進行評估[21-22]。

本實驗采用QuEChERS法對雞蛋中的STC進行提取與凈化，結合Plackett-Burman設計對前處理條件中顯著性因素進行篩選，單因素試驗優化確定關鍵因素最佳范圍，隨后使用響應面中心組合試驗對待測因素進行試驗設計與優化，建立STC提取率的擬合模型并找出最佳實驗條件。最后在最佳條件下進行方法學驗證，并應用于實際樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋為農貿市場及超市中隨機采購的樣品，同一批次樣品視為一份，樣品用均質機均質后于-24 ℃冷藏備用。

STC標準品（純度≥98%） Romer國際貿易（北京）有限公司；STC免疫親和柱 德國R-Biopharm公司；甲醇、乙腈（色譜純） 德國Merck公司；丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附劑、C18吸附劑 上海安譜實驗科技股份有限公司；DisQuE凈化鹽包 美國Waters公司；無水MgSO4、無水Na2SO4、無水CH3COONa、NaCl（分析純）（除無水CH3COONa外其他鹽類使用前均在300 ℃恒溫4 h） 上海凌峰化學試劑有限公司。

STC標準儲備溶液：取STC標準品1.00 mg，用乙腈溶解并定容至10.0 mL，最終質量濃度為100 μg/mL；標準工作溶液用乙腈將儲備溶液稀釋至所需質量濃度。

1.2 儀器與設備

Waters AcquityTM超高效液相色譜配Xevo TQ-S串聯質譜 美國Waters公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

QuEChERS方法參考Xu Jiaojiao[20]和Zhou Jian[23]等并作適當修改：稱取2.50 g雞蛋于50 mL離心管中，再加入5.0 mL水，室溫振蕩2 min后加入10.0 mL乙腈，充分混合均勻后超聲萃取30 min。萃取后加入4.0 g無水Na2SO4，1.43 g NaCl和0.95 g無水CH3COONa進行鹽析，振蕩1 min，8 500 r/min離心3 min，取3.0 mL上層乙腈加入300 mg C18吸附劑和1.5 g無水Na2SO4混合凈化，吸取1.0 mL提取液氮吹濃縮，最后使用1.0 mL 20%乙腈溶液復溶后過0.22 μm濾膜上機分析。

陽性樣品處理按照GB 5009.25—2016《食品中雜色曲霉素的測定》中第二法操作，并根據樣品中毒素含量對提取液稀釋比例作適當調整以免超過凈化柱載荷量。

1.3.2 QuEChERS鹽析

在QuEChERS提取過程中，鹽析分層是直接影響待測物提取率的關鍵步驟。經典QuEChERS萃取法通常使用無水MgSO4和NaCl來進行鹽析[24-25]，但在實際操作過程中發現無水MgSO4在吸水時放熱劇烈并迅速結塊，可能會導致目標物被包裹，同時，瞬間升溫也可能促使某些熱不穩定物質分解。本實驗考察MgSO4、Na2SO4、CH3COONa、NaCl等在QuEChERS提取中對STC提取率的影響，并設計以下6 種組合：4.0 g MgSO4＋1.0 g CH3COONa、4.0 g MgSO4＋1.0 g NaCl、4.0 g MgSO4＋1.0 g NaCl＋1.0 g Na3C6H5O7＋0.5 g Na2C6H6O7、4.0 g CH3COONa＋1.0 g NaCl、4.0 g Na2SO4＋1.0 g NaCl、4.0 g Na2SO4＋1.0 g CH3COONa。以50 μg/kg添加量對空白雞蛋基質進行加標，取3.0 mL上清液用500 mg C18吸附劑進行凈化后濃縮過膜進樣，每種鹽類組合進行3 次平行實驗。

1.3.3 Plackett-Burman試驗與單因素試驗

在確定最佳QuEChERS鹽類組合后，采用Plackett-Burman試驗（n=20），對QuEChERS萃取中水體積、乙腈中甲酸體積分數、超聲萃取時間、無水Na2SO4質量、NaCl質量、無水CH3COONa質量、吸附劑（C18和PSA）質量8 個因素進行考察，試驗設計如表1所示，其中-1代表低水平，1代表高水平，響應值為3 次平行試驗STC提取率的平均值。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Plackett-Burman design

根據Plackett-Burman試驗結果，對篩選出的關鍵因素（PSA、NaCl、無水CH3COONa質量以及甲酸體積分數）進行單因素控制變量試驗，以縮小后續響應面試驗優化范圍。

1.3.4 中心組合試驗設計

在確定每個待優化因素大致的最佳范圍后，對其進行中心組合響應面設計，每個因素進行5 個不同水平的試驗來減少操作中偶然誤差的影響，試驗設計因素與水平如表2所示。

表2 中心組合試驗設計因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for central composite design

利用軟件對試驗結果進行回歸擬合后，可得到試驗因素的二次多項回歸模型，見公式（1）：

式中：Y為預測響應值，Xi和Xj代表獨立變量，δ0為常數項，δi為線性系數，δii為二次項系數，δij為交互項系數，ε為隨機誤差補償項。

1.3.5 高效液相色譜-質譜檢測條件

液相色譜條件：采用Waters CORTECSTM色譜柱（150 mm ×3.0 mm，1.6 μm），柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min，進樣體積10 μL，流動相A：體積分數0.1%甲酸溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～0.8 min，10% B；0.8～2.0 min，10%～20% B；2.0～7.0 min，20% B；7.5～10.5 min，20%～40% B；10.5～11.0 min，40%～60% B；11.0～14.0 min，60% B；14.0～14.2 min，60%～95% B；14.2～16.2 min，95% B；16.2～16.5 min，95%～10% B；16.5～20.0 min，10% B。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正ESI多反應監測模式，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度500 ℃，脫溶劑氣（高純氮氣，純度＞99%）流速750 L/h，碰撞氣（高純氬氣，純度＞99%）流速0.15 mL/min。STC質譜參數：錐孔電壓40 V，母離子m/z 325.09，定性子離子m/z 310.06，定量子離子m/z 281.08，碰撞能量分別為23 eV和32 eV。

1.3.6 基質效應評估與方法學驗證

基質共萃取物會在離子源（尤其在ESI源）中與待測物質競爭發生離子化反應，這也通常導致待測物離子化效率降低，產生基質抑制效應。本實驗中使用提取后加入法來評估雞蛋樣品基質效應，具體操作步驟：在純溶劑將STC標準工作溶液稀釋成7個不同質量濃度的溶液（0.125、0.25、0.5、2.5、10、50、250、1 000 ng/mL）；在空白雞蛋提取液濃縮復溶的同時加入相同質量濃度水平的標準溶液，將所得曲線的斜率進行對比即為絕對基質效應，一般絕對基質效應在80%～120%之間認為是可接受范圍[26]。此外，不同批次的樣品、采樣時間以及喂養飼料成分的差異可能也會導致樣品間內源性成分的不同，此時應評估基質的相對基質效應：取5 份不同的空白樣品，進行絕對基質效應測試，所得基質效應值的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于15%時可認為樣品間不存在較大差異[27]。

方法準確性主要通過三濃度水平加標實驗來評估，每個加標水平實驗平行6 次，精密度則通過日間、日內（連續重復3 d）重復性RSD來表示。取空白雞蛋樣品以1.0 μg/kg水平加標，平行重復6 次實驗，進樣后分別以3 倍和10 倍信噪比為方法檢出限和定量限。

1.4 數據分析

儀器數據分析軟件為Waters Mass Lynx 4.1和Target Lynx 4.1；實驗設計及統計分析軟件為Design-Expert 8.0.6.0，Minitab 17.1.0和IBM SPSS Statistics 19.0。試樣中STC含量按公式（2）計算：

式中：X為試樣中STC含量/（μg/kg）；ρ為由標準曲線計算所得的試樣溶液中STC質量濃度/（ng/mL）；V為最終定容體積/mL；m為樣品質量/g；f為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 QuEChERS法鹽析優化結果

圖2 鹽類組合對STC提取率的影響Fig. 2 Effects of salt combinations on the extraction efficiency of sterigmatocystin

由圖2可知，使用無水Na2SO4和無水CH3COONa作為脫水劑組合均有較高的提取率，考慮到鹽類吸水性能，最終選用無水Na2SO4作為脫水劑。根據組合4和6結果可知，鹽析劑NaCl和CH3COONa兩者效果較好，但其所用量需要進一步優化。

2.2 Plackett-Burman試驗結果及分析

表3 Plackett-Burman試驗設計結果Table 3 Plackett-Burman design with response variable

采用Plackett-Burman設計對實驗中大部分條件進行初步篩選，基于非完全平衡塊原理，能在實驗次數較少的前提下選出對實驗結果有顯著影響的關鍵因素[28]。每個因素各取高低兩水平，其中高水平通常設置為低水平的1.5 倍。通過對表3所得數據進行分析后，將結果用帕累托圖表示，如圖3所示，其中4 個因素的標準化效應值超過了基準參照線（圖中虛線），表明這些因素對提取率影響顯著，在后續試驗中作為主要因素進一步優化。

圖3 試驗因素標準化效應帕累托圖Fig. 3 Pareto chart of the standardized effects

2.3 單因素試驗優化結果

單因素試驗采用控制變量法，對各因素進行五水平考察，確定其最佳值所處范圍供響應面法參考。根據Plackett-Burman試驗結果，假設4 個顯著性因素的中心水平為：PSA吸附劑質量100 mg、NaCl質量1.0 g、無水CH3COONa質量1.0 g、甲酸體積分數4%。因素的5 個考察水平分別為：PSA吸附劑質量0、50、100、150、200 mg；NaCl質量0、0.5、1.0、1.5、2.0 g；無水CH3COONa質量0、0.5、1.0、1.5、2.0 g；甲酸體積分數0%、2%、4%、6%、8%，當考察因素變化時其余因素均固定為中心水平，結果如圖4所示。最終選擇的條件為PSA吸附劑質量0 mg、NaCl質量1.0 g、無水CH3COONa質量0.5 g、甲酸體積分數0%。

圖4 各單因素對提取率的影響Fig. 4 Individual effect of variables on the extraction efficiency

2.4 中心組合設計與響應面試驗結果

根據Plackett-Burman試驗和單因素優化試驗確定的試驗因素和水平，采用中心組合設計試驗對加標雞蛋進行四因素五水平的響應面分析（表4），以減少操作過程中偶然誤差的影響。

表4 中心組合試驗設計結果Table 4 Central composite design with response variable

對表4中所得數據進行二次多元回歸擬合，整理得到對試驗因素一次項、交互項和二次項進行評估的回歸方程如下：

STC提取率=73.77-1.78A＋2.19B＋2.48C-0.42D＋0.80AB-0.047AC＋0.52AD＋0.58BC-0.044BD-0.28CD-0.22A2-1.01B2-1.00C2-0.038D2

對上述結果進行方差分析，表5顯示該擬合方程模型項為極顯著，失擬項為不顯著，在模型系數項中，所有一次項除D項為顯著水平外其余均為極顯著水平，交互項中AB、AD和BC為顯著，二次項B2、C2為極顯著水平。多項式模型方程的擬合程度和模型質量由確定系數（R2）表示，模型擬合良好一般要求R2至少大于0.8[29]，本試驗中R2為0.969 9，調整確定系數（R2Adj）為0.941 9，表明生成的方程與試驗數據擁有96.99%的符合度，能夠解釋94.19%的變化效應，對響應值的預測能力優秀，可信度較高[30]。

根據回歸方程利用軟件作不同因素交互項的響應面圖（圖5），可直觀地反映出各因素交互作用對STC提取率的影響。在響應面圖中2 個考察因素的變化范圍從-α水平到α水平，而其他因素則維持在中心水平。

表5 二次方差模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of the quadratic equation model

圖5 各因素交互作用對雞蛋中STC提取率影響的響應面圖Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effect of variables on the extraction efficiency of sterigmatocystin

由圖5a可知，當甲酸體積分數最低，NaCl質量在1.5 g水平左右時，STC提取率最高。上述現象可解釋為酸性條件不利于STC提取，而適當的鹽度增強了離子效應，促進鹽析分層有利于提高STC提取率。由圖5b可知，當甲酸和PSA均處于最低水平時提取率曲面達到最高點，即在本實驗中不加入甲酸和PSA效果更好。圖5c結果顯示，NaCl和無水CH3COONa兩種鹽的添加量均與STC提取率呈正相關。

在得到的二次回歸方程進行響應面分析后，為獲取最高的STC提取率，利用軟件的Numerical Solutions功能求擬合方程中的響應值Y的最大值，分別對各變量求一階偏導，計算得到最佳條件為：0%甲酸、1.43 g NaCl、0.95 g無水CH3COONa和0 mg PSA。

2.5 方法學驗證結果

2.5.1 基質效應與線性

本實驗選取5 份不同的空白雞蛋進行測試，結果顯示：方法平均絕對基質效應為83.6%，RSD為3.8%。盡管絕對基質效應和相對基質效應均處于可接受范圍，后續實驗仍采用基質匹配曲線法來補償基質效應以獲得更加準確的測定結果，線性范圍在0.125～1 000 ng/mL之間，所得線性相關系數為0.999 6。

2.5.2 準確性、精密度與方法檢測限

準確性及精密度結果如表6所示，該前處理方法測定雞蛋中STC的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。

表6 準確性及精密度結果Table 6 Accuracy and precision of the method

2.5.3 方法應用與實際樣品測定結果

在最佳前處理條件下對45 份雞蛋樣品中的STC進行測定，其中共10 份樣品檢測結果為陽性（典型空白樣品與陽性樣品如圖6所示），污染含量范圍在0.5～3 608 μg/kg（部分樣品檢測結果見表7），推測可能與母雞飼養方式及飼養環境有關。所有陽性樣品均使用免疫親和柱法進行復測，將所得2 種方法測定結果進行對比發現并未存在顯著性差異（P=0.941＞0.05），說明本實驗提出的方法足夠準確，無明顯系統誤差。

圖6 空白雞蛋樣品（A）與陽性雞蛋樣品（B）多反應監測色譜圖Fig. 6 Multiple-reaction monitoring (MRM) chromatograms of blank egg sample (A) and positive egg sample (B)

表7 2 種方法的實際樣品測定結果對比Table 7 Comparison of two methods for the determination of sterigmatocystin in real samples

3 結 論

本研究建立了QuEChERS法提取凈化雞蛋中STC的分析方法，實驗條件經Plackett-Burman設計篩選后使用中心組合設計試驗優化。方法前處理速度快，無需復雜凈化手段，待測毒素提取率高，定量結果準確，靈敏度和精密度較好。將陽性樣品測定結果與GB 5009.25—2016方法進行對比，顯示在2 種方法之間不存在顯著性差異。鑒于本研究發現雞蛋樣品中較高的STC污染率，且有高污染濃度樣本被檢出，建議在適當范圍內擴大對雞蛋中STC的監測，并以此為基礎開展STC污染源以及體內代謝機理的研究調查，為食品中STC風險評估工作的開展提供一定參考依據。

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Optimization and Validation of QuEChERS Extraction for Determination of Sterigmatocystin in Eggs by Response Surface Methodology

ZHOU Jian1,2, XU Jiaojiao1,*, JIN Micong2, CAI Zengxuan1, HUANG Baifen1, REN Yiping3
(1. Department of Physicochemical & Toxicology, Zhejiang Provincial Centre for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China;2. Zhejiang Provincial Key Lab of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals, Ningbo Municipal Centre for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, China; 3. Zhejiang Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University, Application Technology Cooperation Center of National Center for Food Safety Risk Assessment, Jiaxing 314006, China)

A quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) extraction procedure was presented andoptimized for the determination of sterigmatocystin in eggs by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS).The analyte was extracted from samples with aqueous acetonitrile solution, followed by salting out using anhydrous NaSO4,NaCl and CH3COONa,and then purification and concentration with C18sorbent and anhydrous Na2SO4before analysis.Optimization of experimental conditions for maximum extraction efficiency was carried out using Plackett-Burman design,one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The matrix-matched external standard calibration was employed for quantification. Moreover, all positive sampleswere confirmed by immunoaffinity column chromatography. The results of validation showed that good linearity with a correlation coefficient (R2) ＞ 0.999 6 was achieved within the range from 0.125 to 1 000 ng/mL. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) for sterigmatocystin in eggs were 0.1 and 0.5 μg/kg, respectively. Satisfactory recovery (86.8%-90.4%) and inter-day reproducibility (RSD, 1.5%-6.2%)were obtained with blank egg matrices at three spiked levels. Finally, the established method was applied to analyze 45 real samples, 10 of which were positive at concentrations of 0.5 to 3 608 μg/kg.

egg; sterigmatocystin; QuEChERS extraction; response surface methodology; high performance liquid chromatography-mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201724047

O657.63

A

1002-6630（2017）24-0288-08

2017-03-02

周健（1991—），男，碩士，主要從事真菌毒素研究。E-mail：1428541555@qq.com

*通信作者：許嬌嬌（1987—），女，碩士，主要從事食品安全檢驗技術研究。E-mail：jjxucdc@163.com

周健, 許嬌嬌, 金米聰, 等. 響應面試驗優化QuEChERS法提取雞蛋中雜色曲霉毒素工藝及方法學驗證[J]. 食品科學,2017, 38(24): 288-295.

10.7506/spkx1002-6630-201724047. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Jian, XU Jiaojiao, JIN Micong, et al. Optimization and validation of QuEChERS extraction for determination of sterigmatocystin in eggs by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 288-295. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724047. http∶//www.spkx.net.cn