MiRNA-373在皮膚鱗狀細胞癌的表達及對侵襲的影響

夏永華 侯慧芳 李敏 張彩鳳 劉冬 胡華 張孟杰 程賽

453100河南衛輝，新鄉醫學院第一附屬醫院皮膚科（夏永華、李敏、劉冬、胡華、張孟杰、程賽），消化內科（張彩鳳）；新鄉醫學院基礎醫學院病理生理教研室（侯慧芳）

MiRNA-373在皮膚鱗狀細胞癌的表達及對侵襲的影響

夏永華 侯慧芳 李敏 張彩鳳 劉冬 胡華 張孟杰 程賽

453100河南衛輝，新鄉醫學院第一附屬醫院皮膚科（夏永華、李敏、劉冬、胡華、張孟杰、程賽），消化內科（張彩鳳）；新鄉醫學院基礎醫學院病理生理教研室（侯慧芳）

目的 分析microRNA-373（miR-373）在皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）組織和細胞中的表達，探討對皮膚鱗癌細胞侵襲的影響。方法 實時PCR檢測皮膚鱗癌組織和細胞中miR-373的表達，將miR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA轉染皮膚鱗癌A431細胞，采用細胞侵襲實驗分析miR-373表達下調對細胞侵襲的影響，采用Western印跡分析miR-373表達下調對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響。結果 皮膚鱗癌組織（2.465±0.218）和SCL-1細胞及A431細胞（1.864±0.178，2.919±0.277）中miR-373的表達水平顯著高于瘤旁組織和細胞（1.000±0.000），差異有統計學意義（P＜0.05）。在轉移性的皮膚鱗癌患者（3.323±0.344）中，miR-373的表達顯著高于非轉移組（1.914±0.161），差異有統計學意義（t=4.158，P＜0.01）。與未處理組和陰性對照組相比，miR-373模擬物顯著增加皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平和細胞的侵襲能力，而miR-373的抑制劑顯著下調皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平和細胞的侵襲，差異有統計學意義（均P＜0.05）。結論 MiR-373表達下調顯著抑制皮膚鱗癌A431細胞的侵襲，并能顯著下調MMP-2和MMP-9蛋白的表達。

腫瘤，鱗狀細胞；皮膚；微RNAs；腫瘤轉移；microRNA-373

MiRNAs（miRNA）最初鑒定為一類短的單鏈小分子RNA［1］，能調控許多靶基因的表達參與多種細胞生物學過程的調控［2-3］。由于miRNA具有重要的生物學功能，因此，異常miRNA的表達涉及人類疾病的發病機制，特別是腫瘤的發生發展［4］。近來，研究集中在miR-373與腫瘤發生發展的研究上，包括食道鱗狀細胞癌（鱗癌）［5］、宮頸癌［6］、非小細胞肺癌［7］、胃癌［8］等。因此，我們用實時 PCR檢測皮膚鱗癌組織和細胞中miR-373的表達，并分析其表達下調對皮膚鱗癌侵襲的影響，旨在為以miR-373為靶點的皮膚鱗癌的分子靶向治療提供依據。

資料與方法

一、組織標本和細胞株

23例皮膚鱗癌組織和23例瘤旁組織均取自新鄉醫學院第一附屬醫院頭面部皮膚外科手術切除標本，直徑0.5～3 cm，鱗癌標本經組織病理學診斷為皮膚鱗癌?；颊咝g前均未接受放療、化療和免疫治療等。皮膚鱗癌中男15例，女8例；年齡41～75歲，年齡（55.6±8.67）歲；23例中鱗癌Ⅰ級14例，Ⅱ級8例，Ⅲ級1例；9例有淋巴結轉移。對照組為外科手術切緣瘤旁組織。皮膚鱗癌細胞株（SCL-1）由德國柏林自由大學本杰明·富蘭克林醫學中心惠贈，皮膚鱗癌細胞株（A431）購于美國ATCC公司，HaCaT細胞購于德國CLS中心。本研究通過新鄉醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、實驗材料

MiR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA從上海吉瑪公司購買；脂質體2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；實時PCR試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；蛋白裂解液購于寶生物工程（大連）有限公司；鼠抗人單克隆抗體基質金屬蛋白酶（MMP）2和MMP-9購于美國Santa Cruz公司。

三、細胞培養、轉染及分組

SCL-1、A431和HaCaT細胞均培養在含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，將上述細胞置于37℃，5%CO2相對飽和的培養箱中傳代培養，上述實驗細胞處于對數生長期。將MiR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA分別轉染皮膚鱗癌A431細胞中，于48 h進行實驗。實驗分組：未處理組（A431細胞不進行任何處理）、陰性對照組、miR-373模擬物組和miR-373抑制劑組。

四、實時PCR檢測組織和細胞中miR-373的表達

按照Trizol試劑說明書，提取組織和細胞的總RNA，利用miR-373和U6反轉錄引物。miR-373 RT引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGG CAATTGCACTGGATACGACACACCC-3′，U6 RT 引物 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACAAAATA-3′，均由吉凱生物公司合成）按操作說明進行反轉錄，采用實時PCR試劑盒的說明書分別擴增細胞中miR-373基因，并用U6基因作為內參照。hsa-miR-373-3p正向引物：5′-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反 向 引 物 ：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。MiR-373的相對表達量用2-△△Ct計算［9］。

五、細胞侵襲實驗

將miR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA轉染皮膚鱗癌A431細胞中，將基底膜基質原液置于4℃冰箱過夜融化，將基底膜基質原液和預冷的無血清DMEM按照1∶3的比例配制侵襲小室的上室凝膠液，每孔50 μl包被侵襲小室的上室，放置37℃孵育箱孵育2 h使其成膠。Transwell小室上室每孔接種200 μl不含血清細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基500 μl。 將Transwell板置于培養箱中繼續培養24 h后用結晶紫染色。通過顯微鏡觀察被染色細胞，并進行計數。實驗重復3次取均值。

六、Western印跡檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達

將miR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA轉染皮膚鱗癌A431細胞后48 h，收集4組不同處理的A431細胞，采用細胞裂解液提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，并將凝膠上的蛋白電轉移到硝酸纖維素（NC）膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉NC膜2 h，加入一抗（MMP-2、MMP-9和β肌動蛋白）1∶200，于4℃搖床孵育過夜。加入二抗室溫孵育2 h。將NC膜置于ECL（增強化學發光試劑）中反應1～3 min，于暗室中曝光，并通過顯影和定影進而顯示特異的蛋白信號。蛋白表達的灰度值用Image-Pro Plus5.0軟件進行分析，蛋白相對表達為目的基因與內參基因的比值，β肌動蛋白作為內參照。

七、統計學處理

結 果

一、MiR-373在皮膚鱗癌組織中的表達

皮膚鱗癌組織中miR-373的表達水平（2.465±0.218）顯著高于瘤旁組織（1.000±0.000），差異有統計學意義（t=6.713，P＜0.01）。轉移組（9例）和非轉移組（14例）中miR-373的表達，有淋巴結轉移的皮膚鱗癌組織中miR-373的表達水平（3.323±0.344）顯著高于非轉移組（1.914±0.161），差異有統計學意義（t=4.158，P=0.0004）。見表1。

表1 miR-373在瘤旁組織和皮膚鱗狀細胞癌組織中的表達

二、MiR-373在皮膚鱗癌細胞中的表達

2株皮膚鱗癌細胞株中miR-373的表達水平顯著高于HaCaT細胞miR-373的表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平也顯著高于另一株皮膚鱗癌SCL-1細胞，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。miR-373模擬物、抑制劑以及陰性對照用來轉染A431細胞，轉染后48 h采用實時PCR檢測不同組別的細胞中miR-373的表達結果表明，與未處理組和陰性對照組相比，miR-373模擬物顯著增加皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平，而miR-373的抑制劑顯著下調皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 MiR-373在不同皮膚細胞系及各組不同處理A431細胞的中的相對表達水平

三、MiR-373表達下調顯著抑制A431細胞的侵襲能力

用Transwell小室分析miR-373表達下調對皮膚鱗癌A431細胞侵襲能力的影響，與未處理組和陰性對照組相比，miR-373的過表達顯著增加A431細胞的侵襲能力，而抑制miR-373的表達顯著降低A431細胞的侵襲能力，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 MiR-373表達水平的變化對皮膚鱗癌A431細胞侵襲細胞數的影響

圖1 Western印跡檢測不同處理組皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達 1：未處理組；2：陰性對照組；3：miR-373模擬物；4：miR-373抑制劑

四、MiR-373表達下調對MMP-2和MMP-9表達的影響

與未處理組和陰性對照組相比，miR-373的過表達顯著增加MMP-2和MMP-9蛋白的表達，而miR-373表達下調顯著抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達（圖1）。

討 論

研究表明，miR-373參與細胞增殖、凋亡、衰老、中內胚層分化、侵襲和轉移等生物學調控作用。在一些腫瘤中，miR-373發揮癌基因的功能，而在另一些腫瘤中發揮抑癌基因的功能，包括：膽管癌［10］、結腸癌［11］、胰腺癌［12］，miR-373的過表達顯著抑制腫瘤的生長和增殖?？梢酝茰ymiR-373在不同的腫瘤發生發展中具有不同的功能，可能與腫瘤的類型密切相關，因而闡明不同腫瘤中miR-373的表達模式，可能為腫瘤的早期診斷和靶向治療奠定基礎。本研究采用實時PCR檢測23例皮膚鱗癌組織和對應的瘤旁組織中miR-373的表達，結果顯示，皮膚鱗癌中miR-373的表達水平顯著高于瘤旁組織，最為重要的是，miR-373在轉移性的皮膚鱗癌患者中的表達水平顯著高于非轉移的皮膚鱗癌患者，提示miR-373在皮膚鱗癌中發揮癌基因的功能，可能成為皮膚鱗癌患者轉移的預測指標之一。

最近研究表明，miRNAs是細胞遷移和侵襲的關鍵調節子［13］，許多miRNAs有望開發成為腫瘤轉移的預測因子。Zhao等［14］研究表明，miR-4775被鑒定為結腸癌轉移和復發的高風險因子，在對544個結腸癌患者的研究中發現，miR-4775的高表達預示患者預后不佳。闡明miRNAs在腫瘤中侵襲和轉移中的作用及其詳細的分子機制有望為以miRNAs的腫瘤分子靶向治療提供實驗證據。miR-373首次在乳腺癌中被鑒定為促轉移miRNA，采用正向基因篩選技術，Huang等［15］用miRNA表達文庫轉導乳腺癌MCF-7細胞，通過transwell細胞遷移分析其細胞遷移能力，從而鑒定miR-373作為促轉移miRNA分子。最近研究顯示，miR-373的過表達顯著增強Eca109細胞的增殖，促進該細胞的遷移和侵襲，相關抑制miR-373的表達顯著降低KYSE410細胞的增殖，并抑制該細胞的遷移和侵襲，這與TIMP3的表達密切相關［5］。為了證實miR-373在皮膚鱗癌遷移和侵襲中的作用，我們發現miR-373表達下調顯著抑制皮膚鱗癌細胞的遷移和侵襲，進一步發現miR-373表達下調能抑制MMP-2和MMP-9的表達，提示miR-373可能在皮膚鱗癌的侵襲和轉移中發揮作用，后續尚需進一步證實其調控皮膚鱗癌侵襲和轉移的詳細的分子機制。

綜上所述，miR-373在皮膚鱗癌組織和細胞中高表達，其表達下調顯著抑制皮膚鱗癌細胞的遷移和侵襲能力，可能與MMP-2和MMP-9表達下調密切相關，因而可能成為皮膚鱗癌潛在的新的治療靶點。

［1］Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell,1993,75（5）:843-854.

［2］D′Angelo B,Benedetti E,Cimini A,et al.MicroRNAs:a puzzling tool in cancer diagnostics and therapy［J］.Anticancer Res,2016,36（11）:5571-5575.DOI:10.21873/anticanres.11142.

［3］Shah MY,Ferrajoli A,Sood AK,et al.microRNA therapeutics in cancer-an emerging concept［J］.EBio Medicine,2016,12:34-42.DOI:10.1016/j.ebiom.2016.09.017.

［4］Berindan-Neagoe I,Monroig PC,Pasculli B,et al.MicroRNAome genome:a treasure for cancer diagnosis and therapy［J］.CA Cancer J Clin,2014,64（5）:311-336.DOI:10.3322/caac.21244.

［5］Liu W,Li M,Chen X,et al.MicroRNA-373 promotes migration and invasion in human esophageal squamous cell carcinoma by inhibiting TIMP3 expression［J］.Am J Cancer Res,2016,6（1）:1-14.

［6］Wang LQ,Zhang Y,Yan H,et al.MicroRNA-373 functions as an oncogene and targets YOD1 gene in cervical cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun,2015,459（3）:515-520.DOI:10.1016/j.bbrc.2015.02.138.

［7］Seol HS,Akiyama Y,Shimada S,et al.Epigenetic silencing of microRNA-373 to epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer through IRAK2 and LAMP1 axes［J］.Cancer Lett,2014,353（2）:232-241.DOI:10.1016/j.canlet.2014.07.019.

［8］Zhang X,Li X,Tan Z,et al.MicroRNA-373 is upregulated and targets TNFAIP1 in human gastric cancer,contributing to tumorigenesis［J］.Oncol Lett,2013,6（5）:1427-1434.DOI:10.3892/ol.2013.1534.

［9］Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod［J］.Methods,2001,25（4）:402-408.DOI:10.1006/meth.2001.1262.

［10］Chen Y,Luo J,Tian R,et al.miR-373 negatively regulates methyl-CpG-binding domain protein 2（MBD2）in hilar cholangiocarcinoma［J］.Dig Dis Sci,2011,56（6）:1693-1701.DOI:10.1007/s10620-010-1481-1.

［11］Tanaka T,Arai M,Wu S,et al.Epigenetic silencing of microRNA-373 plays an important role in regulating cell proliferation in colon cancer［J］.Oncol Rep,2011,26（5）:1329-1335.DOI:10.3892/or.2011.1401.

［12］Nakata K,Ohuchida K,Mizumoto K,et al.Micro RNA-373 is down-regulated in pancreatic cancer and inhibits cancer cell invasion［J］.Ann Surg Oncol,2014,21 Suppl 4:S564-574.DOI:10.1245/s10434-014-3676-8.

［13］Pencheva N,Tavazoie SF.Control of metastatic progression by microRNA regulatory networks［J］.Nat Cell Biol,2013,15（6）:546-554.DOI:10.1038/ncb2769.

［14］Zhao S,Sun H,Jiang W,et al.miR-4775 promotes colorectal cancer invasion and metastasis via the Smad7/TGFβ-mediated epithelial to mesenchymal transition［J］.Mol Cancer,2017,16（1）:12.DOI:10.1186/s12943-017-0585-z.

［15］Huang Q,Gumireddy K,Schrier M,et al.The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis［J］.Nat Cell Biol,2008,10（2）:202-210.DOI:10.1038/ncb1681.

Expression of microRNA-373 in cutaneous squamous cell carcinoma and its effect on cell invasion

Xia Yonghua,Hou Huifang,Li Min,Zhang Caifeng,Liu Dong,Hu Hua,Zhang Mengjie,Cheng Sai
Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China（Xia YH,Li M,Liu D,Hu H,Zhang MJ,Cheng S）;Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China（Zhang CF）;Department of Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences,Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China（Hou HF）

Xia Yonghua,Email:751195651@qq.com

Objective To investigate the expression of microRNA-373（miR-373）in cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）tissues and cells,and to explore its effects on cell invasion.Methods Real-time PCR was performed to determine the expression of miR-373 in CSCC tissues and paralesional normal skin tissues,as well as in CSCC cell lines（A431 and SCL-1）and HaCaT cells.A431 cells were divided into 4 groups:miR-373 mimic group,miR-373 inhibitor group and negative control group which were transfected with miR-373 mimic,miR-373 inhibitor and negative control miRNA respectively,and untreated group receiving no treatment.Cell invasion assay was performed to evaluate effects of miR-373 downregulation on cell invasion.Western blot analysis was conducted to assess effects of miR-373 downregulation on the protein expression of matrix metalloproteinase-2（MMP-2）and MMP-9.Results Expression of miR-373 was significantly higher in the CSCC tissues（2.465 ± 0.218） than in the paralesional normal skin tissues（1.000 ± 0.000,P ＜ 0.05）,and higher in SCL-1 cells（1.864 ± 0.178）and A431 cells（2.919 ± 0.277）than in HaCaT cells（1.000 ± 0.000,P ＜ 0.05）.Most notably,miR-373 expression was also markedly higher in metastatic CSCC tissues than in non-metastatic CSCC tissues（3.323 ±0.344 vs.1.914 ± 0.161,t=4.158,P=0.000 4）.Compared with the untreated group and negative control group,the miR-373 mimic group showed significantly increased miR-373 expression and invasive ability,while the miR-373 inhibitor group showed markedly decreased miR-373 expression and invasive ability（all P ＜ 0.05）.Conclusion MiR-373 downregulation can significantly suppress the invasion of A431 cells,and obviously decrease the protein expression of MMP-2 and MMP-9.

Neoplasms,squamous cell;Skin;MicroRNAs;Neoplasm metastasis;MicroRNA-373

夏永華，Email：751195651@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.005

河南省教育廳科學技術研究重點項目（2011A320017）；新鄉醫學院科研培育基金（2013QN118）

Fund programs:Key Program for Science and Technology Research of Henan Educational Committee （2011A320017）;Scientific Research Cultivation Fund of Xinxiang Medical University（2013QN118）

2016-12-23）

（本文編輯：吳曉初）