櫛孔扇貝酶解液制備條件優化及其抗氧化性研究

嚴超，牟建樓，陳志周，劉亞瓊，趙歡，齊曉茹

(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000)

櫛孔扇貝酶解液制備條件優化及其抗氧化性研究

嚴超，牟建樓*，陳志周，劉亞瓊，趙歡，齊曉茹

(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000)

以櫛孔扇貝為原料，以水解度和DPPH自由基清除率為指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken方法，通過響應面試驗優化酶解制備具有抗氧化性多肽的扇貝酶解液工藝，并對扇貝酶解液的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化活力和抗超氧陰離子活力進行測定。研究了蛋白酶種類、酶解時間、酶解溫度、加酶量和固液比對櫛孔扇貝酶解液抗氧化性的影響。結果表明：扇貝最佳酶解條件為選擇中性蛋白酶、酶解時間4.7 h、酶解溫度43 ℃、加酶量3.5%、固液比(m/V)1∶5。在此條件下，DPPH自由基清除率達到68.21%，羥自由基清除率為33.74%，總抗氧化活力為0.086 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為106.27 U/g prot。

櫛孔扇貝；酶解；水解度；抗氧化性

櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、翼形亞(Pterimorphia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae)[1]，是我國重要的海產貝類，其味道鮮美，受到廣大消費者的喜愛。扇貝富含豐富的營養物質，不僅包括蛋白質、維生素、脂肪、微量元素等營養成分，還含有非常豐富的多不飽和脂肪酸及縮醛磷脂[2]；扇貝多肽有很多生理功能，具有天然的抗腫瘤成分活性和天然的抗氧化性，能夠阻擋紫外線的氧化損傷[3]。

扇貝通過酶解制備的酶解液中含有豐富的生物活性肽，生物活性肽具有免疫活性、抗氧化、抗高血脂、抗高血壓、抑制腫瘤等功能[4,5]。肽類比同一氨基酸組成的蛋白質的消化吸收率要高，且風味優于單個氨基酸[6]，同時多肽具有極易溶于水、粘度低、抗凝膠等特性，因此在食品和化妝品中有廣泛應用[7]，而且扇貝酶解液具有天然的海鮮風味，是理想的海鮮風味調味品的基料[8]。因水產品中含有豐富的蛋白質及其特殊的氨基酸組成，現在生物活性肽的制備方面具有廣泛應用[9-12]。通過酶解制備的多肽酶解液具有抗氧化活性，制備的酶解液可以用于產品的抗氧化性質的加強，開拓了良好的食品、保健品市場。

本文以櫛孔扇貝為原料，通過單因素試驗和響應面分析法優化了制備具有抗氧化性扇貝酶解液的條件，并對其體外抗氧化性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫛孔扇貝 河北農業大學科技市場，冷凍保存；蛋白酶 北京奧博星生物技術有限公司；甲醛(分析純) 天津市福晨化學試劑有限公司；DPPH 梯希愛化成工業發展有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、抗超氧陰離子試劑盒(A052) 南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽 上海源葉生物技術有限公司。

HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；79-2單、雙向磁力加熱攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；AR423CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；JJ-2組織勻漿機 金壇市億通電子有限公司；PHS-3C智型pH 計 上海虹益儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 扇貝預處理

將冷凍的扇貝解凍后，除雜，清洗，切成顆粒狀，再放入組織勻漿機搗成肉糜狀，放置冰箱冷凍備用。

1.2.2 扇貝酶解工藝流程

扇貝肉糜→加水勻漿→調節pH→加入蛋白酶→保溫酶解→100 ℃滅酶→4500 r/min離心15 min→取上清液→扇貝酶解液。

1.2.3 蛋白酶的選擇

其中溫度和pH均為推薦值，加酶量1%，酶解時間5 h，固液比1∶5，對扇貝進行酶解。分別測定各種酶解液水解度和DPPH自由基清除率。試驗重復3次，確定適宜的蛋白酶。各種蛋白酶最適的酶解條件見表1。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 The enzymatic conditions of different proteases

1.2.4 扇貝酶解液單因素試驗

1.2.4.1 酶解時間的確定

選取中性蛋白酶，在固液比1∶5，加酶量1%，酶解溫度45 ℃的條件下，選取酶解時間分別為3.5，4，4.5，5.5，6 h。分別測定扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗重復3次。

1.2.4.2 酶解溫度的確定

選取中性蛋白酶，在固液比1∶5，加酶量1%，酶解時間4 h的條件下，選取酶解溫度分別為30，35，40，45，50 ℃。分別測定扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗重復3次。

1.2.4.3 加酶量的確定

選取中性蛋白酶，在固液比1∶5，酶解時間4 h，酶解溫度45 ℃的條件下，選取加酶量分別為0.5%，1%，2%，3%，4%。分別測定扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗重復3次。

1.2.4.4 固液比的確定

選取中性蛋白酶，在酶解時間4 h，酶解溫度45 ℃，加酶量1%的條件下，選取固液比分別為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7。分別測定蛋白酶的水解度和DPPH自由基清除率，試驗重復3次。

1.2.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，運用Box-Behnken設計原理采用三因素三水平的響應面分析法，以酶解時間(X1)、 酶解溫度(X2)、加酶量(X3)為變量進行試驗。因素水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 水解度的測定

總氮含量測定：采用GB 5009.5-2010中凱式定氮法；氨基酸態氮(AAN)含量測定：采用GB/T 5009.40-2003中甲醛值法；水解度(DH)計算公式[13]：

1.2.7 DPPH自由基清除率的測定

參照Bae Song Hwan和劉媛等[14，15]的方法，并稍做修改。向具塞試管中依次加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，1 mL蒸餾水，1 mL待測液，振蕩混勻，室溫下避光反應20 min，在517 nm下測其吸光值As；空白組為1 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定吸光值Ax；對照組為1 mL蒸餾水代替樣品，測定吸光值A0，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調零，DPPH自由基清除率(R)公式為：

1.2.8 羥自由基清除率的測定

參照田倩等[16]的方法，并稍做修改。向具塞試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)1 mL，待測樣品溶液1 mL及0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻后加入體積分數為0.01%的H2O2溶液1 mL搖勻，37 ℃水浴1 h，在536 nm波長下測定吸光度(A樣品)；用去離子水代替樣品溶液測定損傷管吸光度(A損傷)；用去離子水代替樣品溶液和H2O2測定未損傷管吸光度(A未損傷)；參照組為等體積的樣品溶液、磷酸鹽緩沖溶液和去離子水，測定吸光度(A參)；空白組為等體積的去離子水和磷酸鹽緩沖溶液，測定其吸光度(A空)。羥自由基清除率的計算公式為：

1.2.9 總抗氧化能力的測定

總抗氧化能力的測定依據試劑盒說明書。以每分鐘每毫克的組織蛋白，在37 ℃條件下使得反應體系的吸光度值每變大0.01時，作為1個總抗氧化能力單位，計算公式為：

1.2.10 超氧陰離子自由基清除率的測定

超氧陰離子自由基清除率的測定依據試劑盒說明書。每克組織蛋白在37 ℃條件下，反應40 min，所能抑制的超氧陰離子自由基相當于1 g的維生素C，所能抑制的該自由基的數量變化值，作為1個單位，計算公式為：

1.2.11 數據處理

2 結果與分析

2.1 最佳蛋白酶的選擇

不同蛋白酶對扇貝酶解效果的影響見圖1。

圖1 不同蛋白酶對扇貝酶解效果的影響Fig.1 Effect of protease types on hydrolysis efficiency of scallop

由圖1可知，不同蛋白酶對扇貝酶解液的效果不同，因為不同的蛋白酶水解蛋白質時，作用的位點不同，水解液的抗氧化活性就不同[17]。根據不同蛋白酶的最適作用條件對扇貝進行酶解，其中中性蛋白酶對扇貝作用的水解度和DPPH自由基清除率分別為(30.88±0.77)%和(66.42±1.41)%。經方差分析，水解度和DPPH自由基清除率都顯著高于其他3種酶(p<0.05)。因此，選擇中性蛋白酶為本試驗水解酶。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 酶解時間的確定

酶解時間對扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見圖2。

圖2 酶解時間對扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH clearance rate

由圖2可知，隨著水解時間的延長，水解度逐漸增大；DPPH自由基清除率先增大后逐漸降低，在酶解時間為4.5 h時，達到最大值(65.87±0.62)%。可能是因為底物濃度的減少或pH改變使酶活力逐漸降低，或水解產物的抑制作用等因素所致，且當酶解時間短時酶解反應不徹底，時間過長有可能出現過度水解，從而影響酶解液的抗氧化活性。經方差分析，不同酶解時間對扇貝酶解液DPPH自由基清除率的影響差異顯著(p<0.05)，綜合考慮，選取適宜的酶解時間為4.5 h。

2.2.2 酶解溫度的確定

酶解溫度對扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on DH and DPPH clearance rate

由圖3可知，隨著酶解溫度的增大，扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率都出現先升高后降低的趨勢，且在45 ℃時，水解度和DPPH清除率都達到最高值，分別為(33.25±0.45)%和(52.64±1.06)%。這是因為在一定范圍內溫度升高，反應速度加快，酶解效率提高，當溫度過高時，會使蛋白酶變性，酶解效率隨之降低[18]。經方差分析，不同酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響差異均顯著(p<0.05)，故選擇適宜的酶解溫度為45 ℃。

2.2.3 加酶量的確定

加酶量對扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見圖4。

圖4 加酶量對扇貝酶解液水解度和 DPPH自由基消除率的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on DH and DPPH clearance rate

由圖4可知，扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加而緩慢升高，當加酶量為3%時，二者都達到最大值，分別為(30.28±0.56)%和(68.86±0.97)%。而隨著加酶量繼續增加，水解度和DPPH清除能力逐漸降低。這是因為隨著加酶量的增加，與底物作用的活性基團增加，加速酶促反應；繼續增加酶量，底物達到飽和或水解過度，使抗氧化活性降低[19]。經方差分析，加酶量為2%，3%，4%時，對水解度的影響差異不顯著，但在加酶量3%時，DPPH自由基清除率顯著高于其他處理(p<0.05)，綜合考慮選擇適宜的加酶量為3%。

2.2.4 固液比的確定

固液比對扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 固液比對扇貝酶解液水解度和 DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of the ratio of solid-liquid on DH and DPPH clearance rate

由圖5可知，水解度和DPPH自由基清除率都隨著液體比例的增加先增加后降低，在固液比為1∶5時達到最大值，分別為(32.17±0.46)%和(67.67±1.20)%。這是因為水解程度隨底物濃度的增大而增大，但底物濃度太高時不利于酶與底物的充分接觸，只有在合適的底物濃度時，蛋白酶才能充分發揮作用[20]。經方差分析，不同固液比對扇貝水解度的影響差異顯著(p<0.05)，且考慮到成本問題，選擇適宜的固液比為1∶5。

2.3 響應面試驗分析

在單因素試驗的基礎上，以酶解時間、酶解溫度、加酶量為變量，DPPH自由基清除率為因變量，進行三因素三水平的響應面試驗，結果見表3。

利用Design Expert 8.6軟件對表3中的試驗數據進行分析，得擬合二次多項式方程：Y=-79.34995+32.40125X1+3.03863X2+2.45780X3-0.042250X1X2+0.42000X1X3-0.043000X2X3-3.37375X12-0.030838X22-0.36580X32。

對該模型及系數進行顯著性分析，結果見表4。

表4 回歸模型顯著性檢驗結果Table 4 Regression model significance test results

續 表

注：R2=0.9781; RAdj2=0.9500; **表示極顯著; *表示顯著;-表示不顯著。

由表4可知，該二次多項式模型具有高度顯著性(p<0.0001)。R2為0.9781，表明該回歸方程回歸效果比較好，可用模型解釋DPPH自由基清除率響應值的變化。失擬項不顯著(p=0.2313>0.05)，表明實驗模型擬合程度良好。分析各模型系數的p值，可知A，B2，C2，AB，AC和BC項的影響顯著，說明酶解溫度、酶解時間和加酶量之間均存在交互作用。

各因素之間交互作用的響應面圖見圖6～圖8。

圖6 溫度與時間對DPPH自由基清除率的影響的響應面圖Fig.6 Response surface of temperature and time on the scavenging ratio of DPPH radical

圖7 時間與加酶量對DPPH自由基清除率的影響的響應面圖Fig.7 Response surface of time and enzyme amount on the scavenging ratio of DPPH radical

圖8 溫度與加酶量對DPPH自由基清除率的影響的響應面圖Fig.8 Response surface of temperature and enzyme amount on the scavenging ratio of DPPH radical

由圖6～圖8可知，在所選因素水平范圍內，響應值有最大值。通過數學模型預測最優的酶解條件為：酶解時間4.75 h、酶解溫度43.56 ℃、加酶量3.53%，此時DPPH自由基清除率最大值為68.09%。

2.4 響應面法優化結果驗證

為了檢驗模型預測的可行性，選取酶解時間4.70 h、酶解溫度43 ℃、加酶量3.50%、固液比1∶5進行試驗，試驗重復3次。測得試驗結果的DPPH自由基清除率為68.21%，與理論預測值相比，其相對誤差為0.12%，說明通過響應面優化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

2.5 抗氧化指標測定結果

在最佳酶解工藝條件下制備酶解液，測定扇貝酶解液的抗氧化指標，蛋白濃度為17.97 mg prot/mL的扇貝酶解液的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力、抗超氧陰離子活力分別為(68.21±0.63)%，(33.74±0.85)%，(0.086±0.05) U/mg prot，(106.27±3.71) U/g prot。

3 結論

試驗確定了采用中性蛋白酶制備抗氧化性扇貝酶解液的條件，在單因素試驗的基礎上選取試驗因素和水平，采用三因素三水平的響應面分析，對酶解溫度、酶解時間、加酶量進行進一步優化，建立了酶解溫度、酶解時間、加酶量三者與DPPH自由基清除率之間的數學模型，模型的回歸效果顯著，對試驗結果具有良好的預測性。通過響應面優化的酶解條件為：酶解時間4.7 h、酶解溫度43 ℃、加酶量3.50%、固液比1∶5。在此條件下，DPPH自由基清除率達到68.21%，羥自由基清除率為33.74%，總抗氧化活力為0.086 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為106.27 U/g prot，說明采用中性蛋白酶制備的扇貝酶解液具有良好的抗氧化能力。

[1]李寧,程潔,孫魯陽，等.中國北方沿海6個櫛孔扇貝群體的AFLP分析[J].中國海洋大學學報:自然科學版,2010,40(4):38-42.

[2]樓喬明,王玉明,徐杰，等.櫛孔扇貝和海灣扇貝脂質及其脂肪酸組成分析[J].中國食品學報,2012,12(11):198-203.

[3]謝靖,韓彥弢,姜國湖，等.扇貝多肽抑制中波紫外線導致的人皮膚成纖維細胞周期阻滯[J].中國海洋藥物,2011(2):53-57.

[4]Aludatt M H,Ereifej K,Abu-zaition A,et al.Anti-oxidant,anti-diabetic,and anti-hypertensive effects of extracted phenolics and hydrolyzed peptides from barley protein fractions[J].International Journal of Food Properties,2012,15(4):781-795.

[5]Martinez-maqueda D,Miralles B,Recio I,et al.Antihypertensive peptides from food proteins: a review[J].Food & Function,2012,3(4):350-61.

[6]朱鳳仙,戴志遠,張燕平，等.酶解制備水產動物活性肽研究進展[J].食品研究與開發,2008,29(11):159-162.

[7]牛瑞,孫謐,于建生，等.扇貝裙邊酶解制備抗氧化肽的實驗研究[J].中國水產科學,2011,18(1):214-221.

[8]趙陽,陳海華,劉朝龍，等.雙酶同步酶解工藝和自溶工藝制備紫貽貝海鮮風味肽[J].中國食品學報,2014,14(9):56-62.

[9]馬賽蕊,胡曉,吳燕燕，等.羅非魚肉蛋白酶解液的抗氧化活性[J].食品科學,2012(19):52-56.

[10]林孌,黃茂坤,董樂，等.風味蛋白酶水解河蜆蛋白的條件優化[J].食品工業,2014(11):92-95.

[11]李彩,桑亞新,王向紅，等.回歸正交旋轉法優化制備扇貝裙邊抗氧化肽[J].中國食品學報,2014,14(4):72-77.

[12]于志鵬,武思佳,趙文竹，等.海洋貝類蛋白源生物活性肽及肽組學的研究進展[J].食品工業科技,2015，36(22)：384-388.

[13]張楨,楊賢慶,馬海霞.Plackett-Burman法和中心組合法優化羅非魚下腳料酶解工藝[J].食品科學,2011(18):1-5.

[14]Bae S H,Suh H J.Antioxidant activities of five different mulberry cultivars in Korea[J].Food Science & Technology,2007,40(6):955-962.

[15]劉媛,王健,牟建樓，等.扇貝貝肉抗氧化肽制備及體外抗氧化實驗研究[J].食品工業科技,2014,35(8):206-209.

[16]田倩,吳燕燕,李來好，等.合浦珠母貝肉酶解液中抗氧化肽的分離及活性研究[J].食品科學,2011(S1):144-148.

[17]李俊江,潘道東,郭宇星，等.鵝肉蛋白酶解條件優化及酶解產物抗氧化活性研究[J].食品科學,2012(3):126-130.

[18]梁帥峰,梁春輝,王偉，等.牡蠣酶解液酶解工藝優化研究[J].食品工業,2015(3):158-161.

[19]郭興鳳,薛園園,吳欣欣.風味蛋白酶水解制備豌豆蛋白抗氧化酶解產物工藝條件優化[J].糧食與油脂,2011(9):44-47.

[20]桑亞新,王向紅,王蘇，等.扇貝裙邊酶解工藝優化及其氨基酸分析研究[J].中國食品學報,2012，12(8):78-86.

StudyonOptimizationofPreparationConditionsandAntioxidantActivityofEnzymaticHydrolysateofChlamysfarreri

YAN Chao, MU Jian-lou*, CHEN Zhi-zhou, LIU Ya-qiong, ZHAO Huan, QI Xiao-ru

(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000，China)

WithChlamysfarrerias raw material, degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate are used as indicators. Based on the single factor test, the Box-Behnken method is used to optimize the enzymatic hydrolysis of scallop hydrolysate with antioxidative polypeptide by response surface test. DPPH free radical scavenging rate, hydroxyl radical scavenging rate, total antioxidant activity and anti-superoxide anion activity are measured. The effects of protease types, enzymolysis time, enzymolysis temperature, enzyme amount and solid-liquid ratio on the antioxidant activity of enzymatic hydrolysate ofChlamysfarreriare studied. The results show that the optimal parameters of enzymolysis are as follows: using neutral protease, the enzymolysis time is 4.7 h, the enzymolysis temperature is 43 ℃, the enzyme amount is 3.5%, the solid-liquid ratio (m/V) is 1∶5. Under the optimum conditions, the scavenging rate of DPPH free radical and hydroxyl radical is 68.21% and 33.74% respectively, the total antioxidant activity is 0.086 U/mg prot, the anti-superoxide anion radical activity is 106.27 U/g prot.

Chlamysfarreri;enzymolysis;degree of hydrolysis;antioxidant activity

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.001

1000-9973(2017)12-0001-06

2017-06-22 *通訊作者

河北省科技計劃項目(14273205D)

嚴超(1992-)，女，碩士，研究方向：食品加工與安全。