葡萄糖-天門冬酰胺體系中丙烯酰胺的生成規律研究

陳卓靜，關亞飛，丁城，吳茜*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心， 武漢 430068；3.湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068； 4.武漢市華測檢測技術有限公司，武漢 430223)

葡萄糖-天門冬酰胺體系中丙烯酰胺的生成規律研究

陳卓靜1,2,3，關亞飛4，丁城1,2,3，吳茜1,2,3*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心， 武漢 430068；3.湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068； 4.武漢市華測檢測技術有限公司，武漢 430223)

對葡萄糖-天門冬酰胺(Glu-Asn)模擬體系中丙烯酰胺的生成規律進行了研究。探討了氨基酸種類、反應底物摩爾比例、加熱時間、加熱溫度和pH等單因素對丙烯酰胺生成量的影響。選取加熱時間、加熱溫度和pH進行正交試驗優化得到丙烯酰胺的最大生成量條件：0.1 mol/L的等摩爾比Glu-Asn體系溶液于180 ℃(油浴)、pH 8.0(PBS)的條件下加熱30 min，丙烯酰胺的生成量為(164.80±13.26) nmol，在此基礎上進行進一步的抑制作用研究。

丙烯酰胺；麥拉德反應；葡萄糖；天冬酰胺；正交

麥拉德反應是食品加工過程中常見的一種由還原糖和氨基酸或者是蛋白質在高溫情況下所發生的反應，食品中的許多風味物質便是在此過程中形成的。而作為其反應的副產物丙烯酰胺，也通常在含有高淀粉含量的熱加工食品中被檢測出來。據Yaylayan等[1]研究得出糖類物質(主要是指還原糖)和天門冬酰胺作為主要的前體物質來參加麥拉德反應并生成丙烯酰胺，同時也有相關文獻報道甘油三酯氧化反應的丙烯醛途徑也可能是生成丙烯酰胺的另外一條通道[2]。影響丙烯酰胺的形成有多種因素，就其反應物本身而言，反應物的種類、含量以及所占比例對丙烯酰胺的形成具有一定影響[3]；就其反應狀態而言，加熱時間、加熱溫度以及pH對丙烯酰胺的生成也具有重大影響[4,5]。本文總結了以下因素：氨基酸種類、葡萄糖-氨基酸比例、加熱溫度、加熱時間以及pH對丙烯酰胺生成的影響。詳細地探討了影響的方式，同時結合正交實驗分析得出丙烯酰胺的最大生成量的條件，為后來丙烯酰胺的抑制提供實驗基礎。

1 儀器和材料

1.1 儀器與試劑

丙烯酰胺標準品(99.9%) 德國Dr.E公司；甲醇、甲酸(色譜純) 美國Fisher公司；亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、磷酸二氫鈉、葡萄糖、磷酸氫二鈉、正己烷 國藥集團化學試劑有限公司；天門冬酰胺 日本Bioship公司。

島津LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；Superclean ENVI C18固相萃取小柱(3 mL) 美國Superclean公司；Waters Atlantis○RT3色譜柱 美國Waters公司；0.22 μm水系針筒式微孔濾膜過濾器 上海楚柏實驗室設備有限公司；Milli-Q水純化系統 法國Millipore公司；冷凍離心機 德國Eppendorf公司；萬分之一電子天平 METTLER TOLEDO公司；油浴鍋(HH-WO，5 mL) 上海一凱儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥拉德反應體系的建立

準確量取0.5 mL的0.2 mol/L的氨基酸和0.5 mL的0.2 mol/L的葡萄糖組成等摩爾比的反應體系(0.1 mol/L) 1 mL溶液置于25 mL密封反應管中，油浴加熱進行麥拉德反應。產物取出后冰浴冷卻，加入5 mL超純水超聲提取10 min，于4 ℃下離心20 min(11000 r/min)，定容至10 mL，樣品處理后進行HPLC分析測定丙烯酰胺含量。

1.2.2 氨基酸種類對丙烯酰胺生成含量的影響

選取具有非極性側鏈的丙氨酸(Ala)、帶有極性側鏈的天門冬酰胺(Asn)、帶正電荷側鏈的賴氨酸(Lys)以及帶負電荷側鏈的谷氨酸(Glu)分別與葡萄糖進行反應。反應體系如1.2.1所示，反應溫度為180 ℃，時間為30 min，每組實驗平行3次。

1.2.3 不同底物比例對丙烯酰胺生成含量的影響

由于一水合天門冬酰胺(Asn·H2O)在室溫(20 ℃)下的溶解度為30 g/L (0.2 mol/L)，故固定天門冬酰胺的量為0.2 mol/L，即分別量取0.5 mL的0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mol/L的葡萄糖溶液加入0.2 mol/L Asn溶液中(構成Glu-Asn為0，1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1的反應體系)進行反應。反應體系如1.2.1所示，反應溫度為30 ℃，反應時間為30 min，以確定不同比例的底物對丙烯酰胺生成量的影響，每組實驗平行3次。

1.2.4 加熱溫度對丙烯酰胺生成含量的影響

0.1 mol/L的等摩爾比Glu-Asn體系溶液分別置于100，120，140，160，180，200 ℃下加熱10 min和30 min，樣品處理后進行HPLC分析測定丙烯酰胺含量，每組實驗平行3次。

1.2.5 加熱時間對丙烯酰胺生成含量的影響

0.1 mol/L的等摩爾比Glu-Asn體系溶液分別置于140，160，180，200 ℃下加熱5，10，20，30，40 min，樣品處理后進行HPLC分析測定丙烯酰胺含量，每組實驗平行3次。

1.2.6 pH對丙烯酰胺生成含量的影響

不同pH值體系的配制。緩沖體系采用PBS溶液母液。0.2 mol/L Na2HPO4：稱取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 mL水中；0.2 mol/L NaH2PO4：稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O溶于1000 mL水中。

1.2.7 正交實驗確定丙烯酰胺生成最大量的條件

選取了加熱時間、加熱溫度以及pH作為單因素，設計三因素三水平的正交實驗L9(34)，優化得到了丙烯酰胺生成最大量的條件，最終通過驗證實驗得以證明。

1.3 統計學分析

數據以平均值±標準偏差(X±S)表示，采用SPSS 13.0軟件進行方差分析(ANOVA)，顯著性差異采用Duncan's多重比較法，表現為p<0.05。各圖由Origin 8.0 Pro繪制，正交分析結果通過Mini Tab 15軟件進行，采用p檢驗法進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同單因素丙烯酰胺生成含量的影響

2.1.1 氨基酸種類對丙烯酰胺生成含量的影響

圖1 不同氨基酸對丙烯酰胺生成量的影響(n=3)Fig.1 Effect of different amino acids on the production of acrylamide (n=3)

注：AA為丙烯酰胺。

由圖1可知，不同的氨基酸與葡萄糖反應生成丙烯酰胺的含量存在很大差異。1 mL等摩爾比的反應體系(0.1 mol/L)中測得的結果表明：丙氨酸(Ala)與葡萄糖反應的產物中并沒有檢測出丙烯酰胺；賴氨酸(Lys)體系中生成了少量的丙烯酰胺，為3.86 nmol；谷氨酸(Glu)體系中丙烯酰胺含量為28.18 nmol；而天門冬酰胺(Asn)體系中丙烯酰胺的含量最大，且顯著大于其他組，達到147.80 nmol。這說明天門冬酰胺作為主要前提物質參加了丙烯酰胺的形成。同時據相關報道，通過同位素(N15)示蹤原子研究表明：丙烯酰胺骨架中的碳原子均來自于天門冬酰胺，與還原糖中的碳骨架無關[6]。因此可以推測，在含有天門冬酰胺較多的食品中，通過適當的前處理，如加入天門冬酰胺酶來將其分解，可以在一定程度上阻止丙烯酰胺的形成，同時也較好地保存了食品的營養價值。

2.1.2 不同底物比例對丙烯酰胺生成含量的影響

Glu-Asn體系中底物比例不同所導致的丙烯酰胺生成含量結果見圖2。

圖2 不同添加比例對丙烯酰胺生成量的影響(n=3)Fig.2 Effect of different addition ratios on the production of acrylamide (n=3)

注：AA為丙烯酰胺。

當單獨加熱天門冬酰胺(比例為0)和單獨加熱葡萄糖(比例為∞)時，體系中均沒有檢測出丙烯酰胺；而當Glu-Asn摩爾比為1∶1時，生成的丙烯酰胺最多，為137.58 nmol ；而當Glu-Asn摩爾比分別為1∶4和4∶1時，丙烯酰胺含量分別為24.24 nmol和41.46 nmol，同時摩爾比分別為1∶2和2∶1時，丙烯酰胺含量分別為47.92 nmol和103.39 nmol。可以看出：兩個相反的比例對比，丙烯酰胺的生成含量前者的均小于后者，可以推測葡萄糖過量所帶來的影響大于天門冬酰胺過量所帶來的影響。

2.1.3 加熱溫度對丙烯酰胺生成含量的影響

分別考察了短時間(10 min)和長時間加熱(30 min)的情況下，分別于100，120，140，160，180，200 ℃的不同加熱溫度對丙烯酰胺生成的影響結果，見圖3和圖4。

圖3 10 min下不同加熱溫度對丙烯酰胺含量的影響 (n=3)Fig.3 Effect of different heating temperatures on the content of acrylamide at 10 min (n=3)

注：AA為丙烯酰胺。

由圖3可知，在加熱10 min的情況下，100 ℃和120 ℃下基本檢測不出丙烯酰胺，丙烯酰胺從140 ℃下開始檢出，為1.79 nmol，隨著加熱溫度的升高，丙烯酰胺含量逐漸變大，在實驗條件規定范圍內，加熱溫度為200 ℃時，達到最大，為38.44 nmol。

圖4 30 min下不同加熱溫度對丙烯酰胺含量的影響 (n=3)Fig.4 Effect of different heating temperatures on the content of acrylamide at 30 min (n=3)

注：AA為丙烯酰胺。

由圖4可知，在加熱30 min的情況下，從120 ℃開始即可檢測到丙烯酰胺的生成，為8.71 nmol，隨著加熱溫度的增加，到180 ℃時，丙烯酰胺含量達到最大值，為157.91 nmol，繼續隨著溫度的升高，200 ℃時丙烯酰胺含量反而降低至132.51 nmol，整個曲線呈現出一個先升高后降低的過程在短時間加熱過程中，隨著溫度的升高，葡萄糖的降解速率加快，加快了體系中丙烯醛的生成率，因此可能通過丙烯醛途徑形成的丙烯酰胺的含量增加[7]，形成了更多的丙烯酰胺。長時間加熱過程中，當溫度在180～200 ℃時，丙烯酰胺的生成含量反而降低，可能是丙烯酰胺的生成作為一個可逆反應，其消除速率大于生成速率的緣故[8]。

2.1.4 加熱時間對丙烯酰胺生成含量的影響

加熱時間對丙烯酰胺生成含量的影響見圖5。

圖5 不同加熱時間(0，5，10，20，30，40 min) 對丙烯酰胺含量的影響(n=3)Fig.5 Effect of different heating time (0,5,10,20,30,40 min) on the content of acrylamide (n=3)

注：AA為丙烯酰胺。

140 ℃和160 ℃的情況下，前10 min幾乎無丙烯酰胺檢出，隨著加熱時間的增加，丙烯酰胺的含量逐漸增大，且到40 min時都達到最大值，分別為54.10 nmol和103.39 nmol。180 ℃和200 ℃的情況下，在5 min能檢測到少量的丙烯酰胺，分別為7.46 nmol和14.26 nmol，隨著時間的增加，丙烯酰胺含量先上升后下降，且200 ℃在20 min時率先達到最大值為196.37 nmol，180 ℃在30 min達到最大值為173.40 nmol，在時間上比200 ℃更晚，且最大值含量小于200 ℃時的含量。同時加熱到40 min以后，180 ℃下丙烯酰胺卻大于200 ℃，分別為118.88 nmol和76.62 nmol。

可以看出高溫長時間加熱會降低丙烯酰胺的含量，可能隨著加熱時間的延長，丙烯酰胺自身發生的分解反應或者與其他物質發生了反應，從而降低了丙烯酰胺的含量。同時也看出高溫情況下，丙烯酰胺會提前形成，這與Robert等的研究相一致[9]。

2.1.5 pH對丙烯酰胺生成含量的影響

pH 6.0～8.0對丙烯酰胺生成含量的影響見圖6。

圖6 不同pH下丙烯酰胺的含量變化曲線 (n=3)Fig.6 Changes of acrylamide content at different pH values (n=3)

注：AA為丙烯酰胺。

由圖6可知，pH對Glu-Asn體系中的丙烯酰胺的形成具有顯著的影響，隨著pH的上升，到7.5時，生成丙烯酰胺的量達到最大，為166.82 nmol，繼續增大pH，則反倒減小。由于pH對麥拉德反應具有較大影響，且在大于7.0時，最易發生麥拉德反應，因此可以預見丙烯酰胺也在此時會達到最大生成量，與實驗結果相符。

2.2 正交實驗

根據上述單因素實驗結果，選取加熱時間、加熱溫度以及pH作為影響因子，進行三因素三水平的正交試驗L9(34)，反應體系為0.1 mol/L等摩爾比的Glu-Asn溶液1 mL，按照1.2.1步驟進行反應，具體參數見表1。

表1 參數與水平Table 1 Parameters and levels

正交實驗結果見表2。

表2 三因素三水平正交實驗設計方法下的丙烯酰胺含量Table 2 The acrylamide content by three-factor and three-level orthogonal experimental design

續 表

由表2可知，3個因子對丙烯酰胺生成含量的影響大小依次是：加熱溫度>pH>加熱時間。此時的最佳組合為A2B2C3。即在1 mL的0.1 mol/L等摩爾比Glu-Asn溶液的反應體系中，加熱時間為30 min，加熱溫度為180 ℃，pH為8.0時，生成的丙烯酰胺含量最大，此選擇的均值主效應圖見圖7。

圖7 丙烯酰胺生成量的均值主效應圖Fig.7 The mean main effect diagram of acrylamide production

注：AA:丙烯酰胺。

用p檢驗法對正交實驗進行方差分析，結果見表3。

表3 丙烯酰胺含量的方差分析Table 3 Variance analysis of acrylamide content

由表3可知，加熱時間和pH對丙烯酰胺含量具有顯著性影響(P<0.05)，加熱溫度對丙烯酰胺含量具有極顯著性影響(P<0.01)。此結果也證明了Glu-Asn反應體系的正交實驗能夠較準確地擬合實驗數據，客觀地反映了丙烯酰胺的生成情況。

2.3 正交驗證實驗

按照正交實驗得到丙烯酰胺生成最大量的條件進行驗證實驗，即1 mL的0.1 mol/L等摩爾比Glu-Asn溶液置于25 mL的密封管中油浴加熱，加熱時間30 min，加熱溫度180 ℃，pH 8.0，按照1.2.1處理并測定丙烯酰胺含量，實驗重復3次，得到丙烯酰胺的含量為(164.80±13.26) nmol，與正交實驗其他相比，為最大生成量，故認為在此條件下，丙烯酰胺達到最大生成值。

3 討論

不同的氨基酸與還原糖反應得到的丙烯酰胺含量有著很大差異。Ezeji等研究了各種氨基酸作為前體物質發現不同的氨基酸生成丙烯酰胺含量不同[10]。本實驗表明：天門冬酰胺與還原糖反應得到丙烯酰胺的量最多。這也說明富含天門冬酰胺的食品，例如土豆、小麥、黑麥等食物加工易生成丙烯酰胺[11-13]，因此可以通過減少原材料中天門冬酰胺的含量來降低食品中丙烯酰胺的形成。

隨著加熱溫度的升高，丙烯酰胺的生成含量不斷變大，且溫度升高還促進了丙烯酰胺提早生成，說明伴隨溫度提升大大強化了丙烯酰胺的形成動力學過程[14]，pH 8.0也在麥拉德反應最佳反應pH條件左右，加大了丙烯酰胺的形成可能。同時高溫長時間加熱反倒降低丙烯酰胺的含量，考慮可能是以下3種情況：第一是高溫長時間加熱到后期生成的丙烯酰胺可能和其他物質發生反應，導致其含量下降；第二是考慮到丙烯酰胺的生成作為一種形成-消除的動力學反應，到后期隨著丙烯酰胺含量的增加，消除動力學逐漸占據主導地位，從而使丙烯酰胺的含量下降[15]；第三則可能是丙烯酰胺作為一種酰胺類物質，到后期進一步發生邁克爾加成或是聚合反應導致其含量下降[16]。

[1]Yaylayan V A,Andrzej W A,Locas C P.Why asparagine needs carbohydrates to generate acrylamide[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2003,51(6):1753-1757.

[2]林流丹,黃才歡,歐仕益.食品中丙烯酰胺形成機理的研究進展[J].現代食品科技,2006,22(1):168-170.

[3]于淼,鄧劉蒙子,江姍姍,等.7種氨基酸對丙烯酰胺的消除作用[J].食品科學,2012,33(17):21-24.

[4]Ehling S,Shibamoto T.Correlation of acrylamide generation in thermally processed model systems of asparagine and glucose with color formation,amounts of pyrazines formed,and antioxidative properties of extracts[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2005,53(12):4813.

[5]章銀良,白明星.葡萄糖/天冬酰胺模擬體系丙烯酰胺形成[J].食品研究與開發,2010,31(4):35-38.

[6]Zyzak D V,Sanders R A,Stojanovic M,et al.Acrylamide formation mechanism in heated foods[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2003,51(16):4782.

[7]Dodson A T.Acrylamide is formed in the Maillard reaction[J].Nature,2002,419(6906):448-449.

[8]Knol J J,Loon W A,Linssen J P H,et al.Toward a kinetic model for acrylamide formation in a glucose-asparagine reaction system[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2005,53(15):6133-6139.

[9]Robert F,Vuataz G,Pollien P,et al.Acrylamide formation from asparagine under low-moisture Maillard reaction conditions.1.Physical and chemical aspects in crystalline model systems[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2004,52(22):6837-6842.

[10]Ezeji T C,Groberg M,Qureshi N,et al.Continuous production of butanol from starch-based packing peanuts[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2003,106(1):375-382.

[11]Springer M，Fischer T，Lehrack A.Development of acrylamide in baked products[J].Getreide Mehl and Brot，2003，57：274-278.

[12]Claus A,Carle R,Schieber A.Acrylamide in cereal products:a review[J].Journal of Cereal Science,2008,47(2):118-133.

[13]袁媛,劉野,陳芳,等.葡萄糖/天冬酰胺模擬體系中丙烯酰胺的產生及其機理研究[J].中國食品學報,2006,6(1):1-5.

[14]Wedzicha B L,Mottram D S,Elmore J S,et al.Kinetic models as a route to control acrylamide formation in food[M].New York: Springer Publishing Company,2005:235-253.

[15]Claeys W L,Vleeschouwer K D,Hendrickx M E.Effect of amino acids on acrylamide formation and elimination kinetics[J].Biotechnology Progress,2005,21(5):1525-1530.

[16]Stadler R H,Scholz G.Acrylamide:an update on current knowledge in analysis,levels in food,mechanisms of formation,and potential strategies of control[J].Nutrition Reviews,2004,62(12):449-467.

StudyontheFormationRuleofAcrylamideinModelSystemofGlucose-Asparagine

CHEN Zhuo-jing1，2，3, GUAN Ya-fei4, DING Cheng1,2,3, WU Qian1,2,3*

(1.College of Bioengineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China; 2.Industrial Fermentation and Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430068, China；3.Hubei Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology, Wuhan 430068, China;4.Wuhan Center Testing International Co.,Ltd., Wuhan 430223, China)

The formation rule of acrylamide in the simulation system of glucose-asparagine (Glu-Asn) is studied. The effects of amino acid species, molar ratio of reaction substrate, heating time, heating temperature and pH on the production of acrylamide are discussed. Select the heating time, heating temperature and pH for orthogonal test to optimize the maximum production conditions of acrylamide: 0.1 mol/L equimolar ratio of Glu-Asn system solution is heated at 180 ℃ (oil bath), pH 8.0 (PBS) for 30 min. Acrylamide generation amount is (164.80±13.26) nmol, and subsequent inhibiting effect is studied on this basis.

acrylamide;Maillard reaction;glucose;asparagine;orthogonality

TS201.24

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.005

1000-9973(2017)12-0023-05

2017-06-28 *通訊作者

陳卓靜(1993-)，女，湖北棗陽人，碩士，研究方向：功能性食品發酵。