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枸杞葉黃酮類化合物體外清除自由基作用研究

2017-12-13 11:06:54范艷麗韓麗娜付麗霞孟雪梅田建文
中國調味品 2017年12期
關鍵詞:黃酮能力

范艷麗,韓麗娜,付麗霞,孟雪梅,田建文

(1.寧夏大學 農學院,銀川 750021;2.寧夏科技廳,銀川 750001)

枸杞葉黃酮類化合物體外清除自由基作用研究

范艷麗1,韓麗娜1,付麗霞1,孟雪梅1,田建文2

(1.寧夏大學 農學院,銀川 750021;2.寧夏科技廳,銀川 750001)

采用有機溶劑浸提法(70%乙醇)提取枸杞葉中的黃酮類化合物,然后以枸杞葉黃酮提取物為研究對象,以Vc和BHT為陽性對照,通過自由基清除實驗體外評價產物的抗氧化活性。結果表明:枸杞葉黃酮提取物中黃酮類化合物的含量為277.7 mg/g。枸杞葉黃酮提取物對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH+、亞硝基自由基、ABTS+具有顯著的清除能力,其最大清除率分別為62%,84%,80%,34%,78%,對Fe3+的還原能力達到Vc和BHT還原能力的50%。結論:所提取的枸杞葉黃酮類化合物具有較高的體外抗氧化活性,可為枸杞葉黃酮類化合物資源的開發利用提供依據。

枸杞葉;黃酮類化合物;抗氧化

枸杞屬落葉灌木植物,是我國傳統的藥食同源植物[1]。枸杞葉與枸杞子同根同源,其營養成分種類與枸杞果基本相同,含有豐富的蛋白質、氨基酸、礦物質等營養成分以及黃酮類化合物、甜菜堿、阿托品等活性成分[2]。《中華本草》記載:枸杞葉“味苦;甘;性涼,補虛益精;清熱明目。主虛勞發熱;煩渴;目赤昏痛”[3],指明枸杞葉具有清熱解暑、養肝明目、軟化血管的保健功效。一直以來,我國民間就有飲用枸杞葉茶和烹制枸杞葉瘦肉湯的飲食方法。黃酮類化合物屬于植物次級代謝產物,主要以甙元和糖甙兩種形式存在,生理活性及藥理作用多樣,如清除氧自由基[4]、抑制腫瘤細胞生長[5]、抗過敏[6]、抗炎保肝[7]等。研究證實:枸杞葉中總黃酮含量遠高于枸杞果[8]。將枸杞葉黃酮提取物添加到高營養的復合羊肉糜中,不僅賦予羊肉糜特有香氣,保持羊肉糜的硬度、膠黏性和咀嚼性,還能夠顯著抑制羊肉糜中不飽和脂肪酸氧化,是一種天然的功能性調味品[9]。本實驗采用有機溶劑浸提法提取枸杞葉中的黃酮類化合物,并進一步研究其體外抗氧化活性,意在探明枸杞葉黃酮類化合物的抗氧化活性及應用前景,為枸杞葉資源能夠更充分合理地利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞芽茶為食品級,購于寧夏科苑示范基地;98%BHT為食品級,購于徐州廣皓生物科技有限公司;DPPH,購于西安沃爾森生物科技有限公司;抗壞血酸(Vc)、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、鄰菲羅啉、無水對氨基苯磺酸、三氯化鐵、30%過氧化氫、焦性沒食子酸、氯化亞鐵、無水乙醇、蘆丁、ABTS、Tris等試劑均為分析純,購于天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

WK-600A型高速中藥粉碎機 上海新諾儀器設備有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-III型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;JDG-0.2型真空凍干試驗機 蘭州科近凍干技術有限公司;TA-XT2i質構分析儀、DL-5-A型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;7230G可見分光光度計 上海精密科技有限公司;101-3型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海東星建材實驗設備有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH.SY21-Ni6-C電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設備廠;DF-2集熱式磁力攪拌機 常州愛華儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞葉黃酮化合物的提取及含量測定

1.3.1.1 枸杞葉黃酮化合物的提取[10]

將枸杞芽茶粉碎,按照料液比1∶70采用70%乙醇于70 ℃下攪拌提取2 h,重復提取1次,合并提取液,在3000 r/min下離心取上清液,55 ℃下旋轉蒸發,濃縮至較小體積后加入石油醚進行脫脂處理,去除葉綠素。用分液漏斗將大部分的石油醚棄除后再進行旋轉蒸發,蒸掉石油醚后經真空冷凍干燥,即得到枸杞葉黃酮類化合物粗品。

1.3.1.2 蘆丁標準曲線的制定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法,以70%的乙醇溶解蘆丁標準品配成濃度為0.20 mg/mL的標準溶液,分別移取標準溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,3.0 mL于10 mL容量瓶中,加入4%的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻靜置6 min,加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻靜置6 min,加入5%的NaOH溶液4.0 mL,用70%乙醇定容,搖勻靜置15 min。以不加標準品為空白,在510 nm下測定吸光度值,建立回歸方程。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.1.3 枸杞葉黃酮提取物的含量測定

配制0.20 mg/mL樣品溶液,進行顯色測定吸光度,根據回歸方程計算出黃酮的濃度,按公式(1)計算產物的黃酮含量。

(1)

式中:X為黃酮含量(mg/g);Y為根據標準曲線方程計算出的提取物質量濃度(mg/mL);V1為定容后的黃酮的體積(mL);C為配制的黃酮溶液的濃度(mg/mL);V2為測定吸光度時所用的黃酮溶液的體積(mL)。

1.3.2 枸杞葉黃酮提取物抗氧化作用的測定

1.3.2.1 超氧陰離子的清除實驗

采用Yang等[11]的方法并略做修改。取5 mL,0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)于具塞試管中,25 ℃水浴中預熱20 min,分別加入1 mL不同濃度(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)的樣品溶液,再加入25 ℃預熱的3 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.5 mL,混勻后于25 ℃水浴中反應5 min,加入1 mL,8 mmol/L的鹽酸終止反應,在299 nm處測定溶液的吸光度,其值記為Ai;空白對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品溶液在紫外可見分光光度計下測定溶液的吸光度,其值記為A0;以0.5 mL的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液在299 nm處測定吸光度,其值記為Aj。按照公式(2)計算得出清除率SR(%)。

(2)

1.3.2.2 羥基自由基的清除活性測定[12]

取12支25 mL的具塞試管并編號,分別向1~5號具塞試管中加入1 mL 0.15 mg/mL的鄰二氮菲溶液、2 mL pH 7.4的PBS緩沖溶液、1 mL 0.2 mg/mL的FeSO4溶液搖勻。將0.2 mg/mL的樣品溶液以0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL分別加入試管中,混勻。6號、7號試管分別標記為受損傷管和空白參照管,8~12號試管以蒸餾水代替樣品作為樣品參照。除空白參照管外,其余試管于37 ℃水浴中恒溫1 h,于波長536 nm處測定吸光度值,按照公式(3)計算得出清除率SR(%)。以Vc和BHT為對照。

(3)

式中:A1為損傷管的吸光度值;A2為空白參照管的吸光度值;A3為樣品管的吸光度值;A4為樣品參照管的吸光度值。

1.3.2.3 DPPH+的清除活性測定

按照李鉉軍等[13]的試驗方法并稍做修改。量取2 mL不同濃度(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)的樣品溶液于具塞試管中,分別加入2 mL,70%的乙醇溶液混勻,避光靜置60 min后在波長517 nm處測定其吸光度,其值記為Aj;分別量取樣品溶液2 mL及2 mL DPPH溶液(濃度為2.0×10-4mol/L)于具塞試管中,混勻后避光靜置60 min,在波長517 nm處測定其吸光度,其值記為Ai;最后再量取70%乙醇溶液2 mL,DPPH溶液2 mL置于具塞試管中,混勻避光靜置60 min,在波長517 nm處測定其吸光度,其值記為A0,按照公式(4)計算得出清除率SR(%)。同時以Vc和BHT為陽性對照。

(4)

1.3.2.4 亞硝基離子的清除活性測定

制備0.2 mg/mL的樣品溶液,將樣品溶液按0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL分別加入具塞試管中,混勻。以蒸餾水代替樣品,作空白對照,同時以Vc和BHT為陽性對照。按鐘方麗等[14]的試驗方法并稍做改動,分別向其中加入5 μg/mL NaNO2溶液1 mL,37 ℃恒溫30 min,加入濃度為0.4%的對氨基苯磺酸溶液1 mL,混勻,靜置5 min,再加入0.5 mL濃度為0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液,混勻后加70%的乙醇定容,靜置15 min后分別在540 nm處測其吸光度,測定的各濃度溶液的吸光度記為A1,用蒸餾水代替樣品,操作方法同上,所測得的吸光度為A0,按照公式(5)計算得出清除率SR(%)。

(5)

1.3.2.5 ABTS+的清除活性測定

按Zhang等[15]的試驗方法并稍做修改。制備濃度為2 mg/mL的樣品溶液,以Vc和BHT為陽性對照。配制濃度為7 mmol/L的ABTS溶液,與等體積濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,避光、4 ℃條件下放置12~16 h[16]。用蒸餾水稀釋ABTS溶液使其在734 nm下的吸光值在(0.7±0.02)之間,取ABTS溶液3.9 mL,加入0.1 mL不同濃度(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)的樣品溶液,搖勻,室溫放置6 min,于734 nm波長處測定吸光度。用蒸餾水代替樣品作為空白對照,按照公式(6)計算得出清除率SR(%)。

(6)

式中:A0為空白管的吸光值;A1為樣品的吸光值。

1.3.2.6 總還原能力的測定[17]

取1 mL樣品(質量濃度分別為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)于具塞試管中,分別加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混勻后于50 ℃水浴中恒溫20 min,分別加入濃度為10%的三氯醋酸溶液2.5 mL,于3000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL,加入蒸餾水2.5 mL和0.1%的FeCl3溶液1 mL,振蕩混勻靜置10 min,在波長700 nm處測定其吸光度。以Vc和BHT為陽性對照。

2 結果與討論

2.1 枸杞葉提取物中總黃酮的含量

按照1.3.1.3的方法測定黃酮的含量,帶入公式(1)計算得:枸杞葉黃酮提取物中的黃酮含量為277.7 mg/g。

2.2 枸杞葉黃酮提取物對超氧陰離子自由基的清除能力

圖2 枸杞葉黃酮提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.2 Superoxide anion radical scavenging ability of flavonoids from Lycium barbarum leaves

超氧陰離子在ROS的形成中起重要作用,可誘導脂質、蛋白質及DNA中的氧化損傷,因此通過測定抗氧化劑對超氧陰離子的清除能力來判斷抗氧化劑的抗氧化能力[18]。由圖2可知,Vc、BHT、黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力均隨樣品濃度的增大而增大。當樣品濃度為0.5 mg/mL時,Vc的超氧陰離子自由基清除率達到70%,BHT和黃酮的清除率也達到60%。當樣品濃度為0.3 mg/mL時,黃酮對超氧陰離子自由基的清除率將近60%,其清除效果優于Vc和BHT。結果表明:清除超氧陰離子自由基方面,黃酮、BHT、Vc的清除能力沒有明顯的差異。

2.3 枸杞葉黃酮提取物對羥自由基的清除能力

圖3 枸杞葉黃酮提取物對羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of flavonoids from Lycium barbarum leaves

羥自由基主要是由過氧化物負離子和過氧化氫反應生成的,能夠殺死紅細胞,降解DNA、蛋白質及脂質等化合物[19],已被公認為自由基病理學中的高度破壞物質。由圖3可知,Vc對羥自由基的清除能力最佳,當樣品濃度達到0.05 mg/mL時,清除率接近100%。BHT對羥基自由基的清除能力略次于Vc。黃酮對羥自由基的清除效果雖不如Vc和BHT,但其對羥自由基的清除率也達到了80%。結果表明:枸杞葉黃酮提取物對羥自由基具有一定的清除能力,其質量濃度對羥自由基清除率影響不明顯。

2.4 枸杞葉黃酮提取物對DPPH+的清除能力

圖4 枸杞葉黃酮提取物對DPPH+的清除能力Fig.4 DPPH+ scavenging ability of flavonoids from Lycium barbarum leaves

抗氧化劑能夠清除自由基,對氧化損傷有很強的保護作用,而DPPH+法已被廣泛用于抗氧化劑清除自由基活性的測定[20]。在DPPH+清除試驗中,抗氧化劑將DPPH+還原為黃色化合物——二苯基聯吡啶,且反應的程度取決于抗氧化劑的供氫能力[21]。由圖4可知,對DPPH+清除能力依次是Vc>黃酮>BHT。黃酮和BHT的清除率均隨樣品濃度的增大而增大,且黃酮對DPPH+的清除能力優于BHT,當樣品的濃度為0.4~0.5 mg/mL時,黃酮對DPPH+的清除率達到80%左右,而BHT對DPPH+的清除率在70%左右。結果表明:枸杞葉黃酮提取物對DPPH+具有一定的清除能力,且與其質量濃度呈正相關。

2.5 枸杞葉黃酮提取物對亞硝基離子的清除能力

圖5 枸杞葉黃酮提取物對亞硝基離子的清除能力Fig.5 Nitroso ion scavenging ability of flavonoids from Lycium barbarum leaves

胡利等[22]研究指出,桑葉黃酮具有較強的清除亞硝酸鹽作用,并且該清除作用隨著反應時間、溫度及黃酮濃度的增加而增大,提示其可用于添加亞硝酸鈉作為發色劑的肉制品。由圖5可知,在清除亞硝基自由基方面,清除能力依次是Vc>黃酮>BHT,Vc對亞硝基離子的清除能力明顯強于黃酮和BHT,當樣品的濃度達到0.08 mg/mL時,清除率達到80%。黃酮對亞硝基離子的清除率與其質量濃度呈正相關,當樣品的濃度達到0.1 mg/mL時,其清除率為34%。BHT對亞硝基離子的清除率明顯弱于Vc,也略弱于黃酮,當質量濃度為0.1 mg/mL時,對亞硝基的清除率只有27%左右。結果表明:枸杞葉黃酮提取物對亞硝基離子具有清除能力,但清除效果不如其對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除效果。

2.6 枸杞葉黃酮提取物對ABTS+的清除能力

圖6 枸杞葉黃酮提取物對ABTS+的清除能力Fig.6 ABTS+ scavenging ability of flavonoids from Lycium barbarum leaves

ABTS+清除實驗基于評價抗氧化劑在體外清除穩定ABTS+的能力[23]。由圖6可知,對ABTS+的清除能力依次是Vc>BHT>黃酮。當樣品的濃度在0.1~0.5 mg/mL時,Vc和BHT對ABTS+的清除率均達到90%以上。樣品的濃度為0.1 mg/mL時,黃酮對ABTS+的清除率不足10%,但是它的清除能力隨著樣品濃度的增大而明顯升高,當樣品濃度達到0.5 mg/mL時,其對ABTS+的清除率達到80%左右,接近BHT和Vc的清除率。結果表明:枸杞葉黃酮提取物能夠有效地清除ABTS+,且與其質量濃度呈正相關。

2.7 枸杞葉黃酮提取物的還原能力

圖7 枸杞葉黃酮提取物的還原能力Fig.7 Reducing ability of flavonoids from Lycium barbarum leaves

樣品的還原能力能夠反映一定的抗氧化性,抗氧化劑可將Fe3+絡合物還原成綠色或藍色的Fe2+絡合物。試驗通過顯色反應可以測定出Fe3+被還原成Fe2+程度的高低,從而可以判斷出黃酮類化合物還原能力的強弱。由圖7可知,Vc、BHT、黃酮的還原能力均隨樣品濃度的增大而增大。樣品濃度為0.1 mg/mL時,黃酮和Vc的還原能力相當,吸光度值均在0.3左右,而此濃度BHT的吸光度值達到0.6。當樣品的濃度為0.5 mg/mL時,Vc和BHT的吸光度均達到1.0左右,而黃酮的吸光度為0.5左右,說明在還原能力方面,枸杞葉黃酮提取物弱于Vc和BHT,基本上達到了它們還原能力的50%。

3 結論

本研究采用有機溶劑浸提法,對枸杞葉中的黃酮類化合物進行提取,采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測得提取產物的黃酮含量為277.7 mg/g,提取物呈黃綠色的粉末狀物質。以BHT和Vc為陽性對照,對枸杞葉黃酮提取物進行體外抗氧化活性研究,結果表明:在一定的濃度范圍內,枸杞葉黃酮類化合物的還原能力是Vc和BHT還原能力的50%,其對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH+、亞硝基自由基、ABTS+具有顯著的清除作用,其最大清除能力分別為62%,84%,80%,34%和78%。由此可知,枸杞葉黃酮提取物可以作為一種天然抗氧化劑或調味品應用于油脂及含油食品、肉制品或高檔植物飲料,該研究結果為枸杞葉資源的綜合利用提供了理論基礎。

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StudyonFreeRadicalScavengingEffectofFlavonoidsfromLyciumbarbarumLeavesinVitro

FAN Yan-li1, HAN Li-na1, FU Li-xia1, MENG Xue-mei1, TIAN Jian-wen2

(1.College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;2.Ningxia Science and Technology Department, Yinchuan 750001, China)

The flavonoids fromLyciumbarbarumleaves are extracted by organic solvent extraction(70% ethanol).And the antioxidant activity of flavonoids fromLyciumbarbarumleaves is evaluated by radical scavenging experiments in vitro taking Vc and BHT as positive controls. The results show that the content of flavonoids in the extract is 277.7 mg/g. The flavonoids fromLyciumbarbarumleaves have significant scavenging ability on superoxide anion radical, hydroxyl radical, DPPH+, nitroso radical and ABTS+, and the maximum removal capacity is 62%, 84%, 80%, 34%, 78% respectively, meanwhile, the reducti on ability of the product on Fe3+reaches 50% of that of Vc and BHT. Conclusion:The flavonoids fromLyciumbarbarumleaves have high antioxidant activity in vitro, which can provide the basis for the development and utilization of flavonoids fromLyciumbarbarumleaves.

Lyciumbarbarumleaves;flavonoids;antioxidation

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.007

1000-9973(2017)12-0032-06

2017-06-15

國家自然科學基金資助項目(31660438)

范艷麗(1980-),女,副教授,博士,研究方向:食品營養與特色農產品加工。

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