襄陽大頭菜腌制液生物膜真菌多樣性研究

趙慧君，沈馨，董蘊，吳競，凌霞，胡事成，郭壯*

(1.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北 襄陽 441000)

襄陽大頭菜腌制液生物膜真菌多樣性研究

趙慧君1，沈馨1，董蘊1，吳競2，凌霞2，胡事成3，郭壯1*

(1.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北 襄陽 441000)

采集了3 個襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品，使用Miseq高通量測序技術對其真菌微生物群落結構進行了解析。在門水平上，Ascomycota平均含量高達99.99%，相對含量大于1%的真菌屬分別為Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其平均相對含量分別為56.10%，40.96%和2.32%。在分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)水平上，發現24 個核心OTUs，其中OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)的累計平均相對含量為83.60%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構成，生物膜共有大量的核心真菌菌群。

襄陽大頭菜；生物膜；真菌；多樣性；Miseq

作為我國四大名腌菜之一的襄陽大頭菜是以芥菜為原料，采用獨特的“三腌、五鹵、六曬”工藝歷時18個月腌制而成，該制作工藝至今已有近2000年的歷史。因具有口感脆嫩、香味濃郁和歷史悠久的特點，2007年襄陽大頭菜被列為中國國家地理標志產品，2009年又被列為湖北省非物質文化遺產[1]。襄陽大頭菜的腌制主要在腌制池或缸中進行，長達18個月的腌制過程實質上是微生物發酵、食鹽高滲透壓和蛋白質分解等一系列生化反應協同作用的結果，該過程賦予了大頭菜獨特的風味和口感[2]。然而襄陽大頭菜的生產總體處于粗放式加工狀態，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現，大頭菜的脆度明顯降低且產生刺激性氣味，最終導致產品品質下降直至失去經濟價值。雖然將生物膜撈出后大量添加食鹽可以暫時延緩這一現象的再次發生，但生物膜一經形成就很難控制和去除[3]。

16S rRNA和18S rRNA基因測序技術作為系統遺傳學和微生物生態學的“黃金標準”方法[4]，長期應用于環境樣品微生物群體的物種組成和豐度研究中。以Miseq為代表的高通量測序技術采用宏基因組學的研究策略，通過將環境樣品中微生物的基因組混合作為一個整體進行研究，不僅揭示了微生物群體的物種組成及豐度信息，亦可以解析物種的生物功能，打破了傳統微生物學基于純培養研究的局限性[5]。

本項目以表面長生物膜大頭菜腌制液為研究對象，從宏基因組層面，以真菌18S rRNA基因全長為Miseq測序靶點，在各系統分類學地位上對生物膜的真菌群落結構進行了揭示，以期為后續因產生生物膜而導致襄陽大頭菜品質下降這一產業化問題的解決提供數據支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：購于德國QIAGEN公司；dNTPs Mix，5×TransStartTM，FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase：購于北京全式金生物技術有限公司；DNA 1000 試劑盒：購于美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統 美國BIO-RAD公司；ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；2100芯片生物分析儀 美國Agilent公司；Miseq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北省襄陽孔明菜有限公司的腌制缸中采集長生物膜的大頭菜腌制液樣品3份。樣品采集時，首先使用組織搗碎機將生物膜與腌制液攪拌均勻，然后立即置于4 ℃采樣箱內，運送回實驗室后置于-80 ℃冷凍儲存，48 h內完成DNA的提取。

1.3.2 DNA提取

大頭菜腌制液3000 g 離心10 min后收集菌體，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA，繼而使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對DNA的濃度和純度進行測定，符合后續試驗要求的DNA保存在-20 ℃備用。

1.3.3 真菌18S rRNA擴增

PCR擴增體系為：5×PCR緩沖液4 μL，2.5 m MdNTPs mix 2 μL，5 μmol/L正向引物0.8 μL，5 μmol/L反向引物0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，體系用ddH2O補充至20 μL。其中真菌18S rRNA正向引物為SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')，其反向引物為SSU1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')，且在正向引物中加入7個核苷酸標簽(barcode)。

擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃ 10 min，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后，置-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 樣品平衡及Miseq高通量測序

使用2100芯片生物分析儀將每個樣品的DNA模板稀釋至100 nmol/L，混合均勻后寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司使用Miseq平臺進行高通量測序。

1.3.5 序列的拼接及質控

按照以下流程進行序列的拼接：根據成對序列之間的重疊關系，將雙端序列數據拼接成一條序列；根據barcode將所有序列劃分到各個樣品并對序列方向進行校正；切掉序列barcode和引物。

若在序列拼接過程中存在以下情況則將該序列予以剔除：重疊區的堿基數小于10 bp；重疊區的最大錯配比率大于0.2；barcode堿基錯配；引物堿基錯配數大于2 bp；切掉barcode和引物后若序列堿基數小于50 bp亦予以剔除。

1.3.6 生物信息學分析

使用QIIME(v1.7.0)分析平臺[6]對過控合格的序列按照以下流程進行物種分析：

采用PyNAST[7]軟件將序列對齊；

以100%的相似度用UCLUST軟件[8]劃分序列得到無重復單一序列集，建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)；

以97%相似性使用UCLUST軟件進一步劃分OTU；

從每條OTU選取1 條代表性序列，使用SILVA[9,10]數據庫進行比對，獲得門、綱、目、科、屬和OTU水平上各真菌的分類信息；

使用 FastTree 軟件[11]繪制基于 OTU 代表序列的系統發育進化樹，計算香農指數 (Shannon index)、Observed Species(發現物種數)和超 1 指數 (Chao1 index)，進而對襄陽大頭菜腌制液生物膜alpha多樣性進行計算。

1.3.7 核酸登錄號

本研究中所有Miseq序列數據已提交至MG-RAST數據庫，ID號為mgp79759。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的3 個腌制液生物膜樣品18S rRNA測序情況及各分類地位數量見表1。

表1 樣品18S rRNA測序情況及各分類地位數量Table 1 Sample 18S rRNA sequencing and the number of taxonomic status

注：計算每個樣品Chao1和Shannon指數時，樣品的測序量均為30010條序列。

由表1可知，通過Miseq高通量測序，本研究采集的3 個樣品共產生了101882 條高質量16S rRNA序列，平均每個樣品產生33961 條。經過100%序列鑒定聚類分析后，本研究共得到16833 條代表性序列，根據序列的97%相似性進行操作分類單元劃分后，共得到93 個OTU，每個樣品平均51 個OTU。進一步使用稀疏曲線和香農指數曲線對本研究產生的數據量是否滿足后續生物信息學分析進行了評價，其結果見圖1。

圖1 稀疏曲線圖(A)和香農指數曲線圖(B)Fig.1 Sparse curve (A) and Shannon index curve (B)

由圖1可知，隨著測序量的增加，稀疏曲線未進入平臺期(A)而香農指數曲線進入了平臺期(B)，這說明隨著測序量的增加，新的種系型可能會被發現，但微生物的群落結構不會再發生改變了，由此可見，本研究產生的序列數是可以滿足后續生物信息學分析要求的。

2.2 基于不同分類地位核心菌群相對含量的分析

本研究使用SILVA數據庫對OTU代表性序列進行了同源性比對，所有的序列鑒定為2 個門、6 個綱、7 個目、8 個科和12 個屬，僅有0.006%的序列不能鑒定到屬水平。其中MBZ1和MBZ2樣品中僅發現Ascomycota這1 個真菌門，在MBZ3樣品中除Ascomycota外，亦發現了Basidiomycota，但其相對含量僅為0.0063%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要隸屬于Ascomycota。如果某一真菌屬在3 個樣品中的平均相對含量大于1.0%，則將其定義為優勢真菌屬。不同樣品中優勢真菌屬相對含量的比較分析見圖2。

圖2 襄陽大頭菜腌制液生物膜中優勢真菌屬相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis of the relative content of dominant fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖2可知，納入本研究的3個腌制液生物膜樣品中優勢真菌屬分別為Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其相對含量分別為56.10%，40.96%和2.32%，其他9個屬的相對含量累計為0.62%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構成。徐婷等使用YPD培養基，采用純培養的方法從長有生物膜的襄陽大頭菜鹵水中分離了1株酵母菌，并將其鑒定為Zygosaccharomycesrouxii。值得一提的是，經文獻調研發現，在泡菜[12]和葡萄酒[13]等發酵食品的制作過程中亦有生物膜現象的出現，類似的問題同樣影響了上述食品行業的發展。饒瑜等[14]對泡菜生物膜中真菌進行了分離，研究表明Pichiakluyveri可以導致生物膜的形成。由此可見，Zygosaccharomyces下的真菌種可能具有致生物膜產生的作用。

如果某一個真菌屬在3個樣品中均存在，則本研究將其定義為核心菌屬，襄陽大頭菜腌制液生物膜中核心真菌屬的構成及含量見圖3。

圖3 襄陽大頭菜腌制液生物膜中核心真菌屬的構成及含量分析Fig.3 Analysis of the composition and content of core fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖3可知，Zygosaccharomyces，Pichia和Candida既為優勢屬又為核心屬，除此之外，Phialosimplex亦為核心屬，其相對含量為0.60%。本研究進一步統計了OTU在3個樣品中出現的次數，其結果見圖4。

圖4 OTU在襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中出現次數統計Fig.4 The number of times of occurrence of OTU in the samples of biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖4可知，3個襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品共產生93個OTU，然而在3個樣品中僅出現1 次的OTU為56個，占OTU總數的60.22%，所包含序列數為530條，占所有質控后合格序列數的0.52%。本研究每個樣品平均產生33960條序列，而每個樣品中僅出現1次的OTU平均每個含有9.5條序列，則每個僅出現1次的OTU其包含序列的平均相對含量僅為0.028%。基于OTU水平的Venn圖見圖5。

圖5 基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由圖5可知，MBZ1和MBZ2共有5個OTUs和21條序列，MBZ1和MBZ3共有4 個OTUs和60 條序列，MBZ2和MBZ3共有4 個OTUs和218條序列。雖然納入本研究的3個襄陽大頭菜生物膜樣品中共發現24個真菌的核心OTUs，占OTU總數的25.81%，但其包含101053條序列，占所有質控后合格序列數的99.19%。由此可見，雖然有的襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中可能含有一些較為獨特的種系型，但其相對含量是極低的，因而樣品共有大量的核心真菌菌群，核心OTU在3個襄陽大頭菜生物膜樣品中相對含量的熱圖見圖6。

圖6 核心OTU在各襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中相對含量的熱圖Fig.6 Heat map of the relative content of core OTU in biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

注：依據OTU的進化關系建立了左側的系統發育樹。

由圖6可知，24個OTUs中，15個隸屬于Zygosaccharomyces，各有3 個隸屬于Pichia，Phialosimplex和Candida。值得一提的是，OTU62(Zygosaccharomyces)在3個樣品中的相對含量高達54.02%，51.23%和24.14%，而OTU37(Phialosimplex)相對含量高達33.07%，24.59%和63.74%，2個OTU的累計相對含量分別為87.09%，75.82%和87.88%，這也進一步證實了雖然襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品共有大量的核心真菌菌群，但核心真菌菌群的多樣性相對較低，2個OTUs的相對含量就占到了真菌類群的80%左右。本研究進一步對核心屬和核心OTU之間的相關性進行了分析，其結果見圖7。

圖7 核心屬和平均相對含量大于1.0%的核心OTU相關性的熱圖Fig.7 Heat map of correlation among the core fungi genera (A) and OTU with relative content more than 1.0% (B)

注：依據相關系數建立左側和頂端聚類樹。

由圖7可知，4個核心真菌屬之間相關性均不顯著(P>0.05)，除OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)外，OTU86(Candida)的平均相對含量也大于1.0%，然而3 個OTU之間亦均無相關性(P>0.05)。

3 結論

襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構成，雖然有的樣品中可能含有一些較為獨特的種系型，但生物膜樣品共有大量的核心真菌菌群。

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StudyontheDiversityofFungalMicrofloraofBiomembraneinXiangyangMustardRootBrine

ZHAO Hui-jun1, SHEN Xin1, DONG Yun1, WU Jing2, LING Xia2, HU Shi-cheng3, GUO Zhuang1*

(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food, College of Chemical Engineering and Food Science, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China; 2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision, Xiangyang 441021, China; 3.Xiangyang Kongmingcai Co.,Ltd ., Xiangyang 441000, China)

In the current study, 3 biomembrane samples of Xiangyang mustard root brine are collected, and the fungal microbiota are studied by Miseq high throughput sequencing technologies.Ascomycotais the most dominant fungal phylum with the relative abundance of 99.99%. At the phylum level,Zygosaccharomyces,PichiaandCandidaare constituting more than 1% of total sequences, with the relative abundance of 56.10%, 40.96% and 2.32% respectively. At the OTU level,24 OTUs are shared by all samples, and the cumulative average relative content of OTU62(Zygosaccharomyces)and OTU37(Phialosimplex)is 83.60%. The results indicate that the fungal microbiota of biomembrane in Xiangyang mustard root brine are main consisted byZygosaccharomycesandPichiabelong toAscomycota, and biomembrane samples have a large number of core fungal flora.

Xiangyang mustard root；biomembrane；fungus；diversity；Miseq

TS255.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.013

1000-9973(2017)12-0061-05

2017-07-15 *通訊作者

湖北省食品藥品監督管理局科研項目(201601025)；襄陽市科技計劃研究與開發項目(2016)；湖北文理學院食品新型工業化學科群建設項目(2017)

趙慧君(1979-)，女，講師，博士，研究方向：食品生物技術；

郭壯(1984-)，男，副教授，博士，研究方向：食品生物技術。