花椒中生物堿測(cè)定方法及提取工藝研究

石雪萍

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，南京 210007)

花椒中生物堿測(cè)定方法及提取工藝研究

石雪萍

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，南京 210007)

采用乙醇水浴浸提法提取生物堿，電位滴定法測(cè)定生物堿含量。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了從花椒中提取生物堿的工藝參數(shù)的適宜范圍，并進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。結(jié)果表明：采用電位滴定法能夠準(zhǔn)確找到滴定終點(diǎn)，再根據(jù)酸堿反應(yīng)可計(jì)算出生物堿含量。采用乙醇熱浸提法通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究了某品種花椒中總生物堿的提取工藝，乙醇熱浸提最適宜的提取工藝條件為：采用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇為提取劑，料液比為1∶10，浸提溫度為70 ℃，浸提3 h，乙醇熱浸提法提取生物堿的最佳提取率為2.11%。

花椒；生物堿；測(cè)定；提取工藝

花椒(學(xué)名：ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，蕓香科植物青椒或花椒的干燥成熟果實(shí)。花椒還是一味傳統(tǒng)的中藥，具有很多藥用價(jià)值。可以溫暖身體，去除寒氣和濕氣，保護(hù)胃和脾。可疏通腸胃，促進(jìn)排尿、便，有利防治便秘；對(duì)女性生理期的疼痛也具有相當(dāng)好的緩解作用；同時(shí)對(duì)驅(qū)蟲殺蟲、治療高血壓、糖尿病和心臟病都有一定的保護(hù)作用[1]。

花椒中的功能性成分主要包括花色苷(黃酮類)、生物堿、木質(zhì)素、脂肪酸等。花椒本屬類植物普遍都含有生物堿類[2]。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者、研究者對(duì)花色苷及生物堿的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功效進(jìn)行了研究[3-5]。

生物堿是一類含氮的堿性有機(jī)化合物，有類似于堿的性質(zhì)。大多數(shù)都有氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，氮素多包含在環(huán)內(nèi)，皆有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一，還具有光學(xué)活性[6]。生物堿的檢測(cè)方法主要有酸性染料比色法[7]、電位滴定法[8]、紫外吸收法[9]等。提取方法主要有水提取法、氨-氯仿法、有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法[10，11]等。

花椒中的生物堿是花椒呈現(xiàn)麻味的主要成分物質(zhì)，目前諸多學(xué)者對(duì)花椒生物堿的提取測(cè)定產(chǎn)生了濃厚的興趣。本實(shí)驗(yàn)采用電位滴定法測(cè)定花椒中生物堿，用乙醇熱浸提法進(jìn)行提取，正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，旨在對(duì)花椒的進(jìn)一步研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

花椒 南京市白下區(qū)石門坎蘇果超市；奎寧(對(duì)照品) 上海純優(yōu)生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、濃硫酸、乙醇、濃氨水、鄰苯二甲酸氫鉀等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 上海比朗儀器有限公司；干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHS-3C電位滴定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理

花椒放入烘箱中進(jìn)行干燥，再將干燥后的花椒放入豆?jié){料理機(jī)中，粉碎至過(guò)40～60目篩，密封包裝后置于陰涼干燥處備用。

取樣品適量，用20倍石油醚進(jìn)行脫脂處理。萃取3次，每次12 h。抽濾，取濾渣，風(fēng)干備用。

2.2 溶液的配制及標(biāo)定

2.2.1 溶液配制

0.02 mol/L H2SO4：取2 mL 98%濃硫酸, 定容至1000 mL，即得。

0.04 mol/L NaOH：取1.6 g NaOH粉末，溶于蒸餾水中，定容至1000 mL，即得。

2.2.2 溶液標(biāo)定

2.2.2.1 NaOH溶液濃度的標(biāo)定

準(zhǔn)確稱取0.1～0.125 g鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)3份，分別于250 mL的錐形瓶中，加入50 mL的水使之溶解。再加酚酞指示劑2滴，用待標(biāo)定的NaOH溶液滴定至溶液呈微紅色，30 s不褪色，即為終點(diǎn)。記錄所用NaOH溶液體積，計(jì)算NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，并用Q檢驗(yàn)法檢驗(yàn)所得結(jié)果，最后計(jì)算結(jié)果的平均值和相對(duì)平均偏差。相對(duì)平均偏差應(yīng)不超過(guò)0.2%，見(jiàn)表1。

表1 NaOH溶液濃度的標(biāo)定Table 1 The calibration of NaOH solution concentration

公式：CNaOH=[mKHP/(M×V)]×1000，M=204.2 g/mol。

2.2.2.2 H2SO4溶液濃度的標(biāo)定

用已標(biāo)定的NaOH溶液進(jìn)行標(biāo)定，取3支錐形瓶，分別加入10 mL已標(biāo)定的濃度為0.378 mol/L的NaOH溶液，再加入2滴甲基橙，用待標(biāo)定的H2SO4溶液進(jìn)行滴定至溶液由黃色變?yōu)槌壬礊榻K點(diǎn)，見(jiàn)表2。

表2 H2SO4溶液濃度的標(biāo)定Table 2 The calibration of H2SO4 solution concentration

2.3 電位滴定法測(cè)定生物堿含量

2.3.1 花椒中生物堿的提取

稱取1 g干的花椒粉于錐形瓶中，加入20倍的70%乙醇，密封，稱重計(jì)數(shù)，于60 ℃恒溫水浴中浸提2 h；取出稱重，加乙醇至恒重；抽濾3次，取濾液；得到生物堿的抽濾液。

2.3.2 花椒中生物堿的測(cè)定

取上述待測(cè)濾液10 mL，加入20 mL已標(biāo)定的H2SO4，將復(fù)合玻璃電極插入溶液中，選擇“mV”模式，開動(dòng)攪拌器，用已標(biāo)定的NaOH滴定，記錄電動(dòng)勢(shì)mV變化和對(duì)應(yīng)NaOH消耗量，儀器以mV值突躍判定滴定終點(diǎn)。將電動(dòng)勢(shì)對(duì)NaOH消耗的體積作圖，再對(duì)電動(dòng)勢(shì)求一階導(dǎo)數(shù)，一階導(dǎo)數(shù)對(duì)體積作圖，峰尖對(duì)應(yīng)的值即是滴定終點(diǎn)[12]。電位滴定圖見(jiàn)圖1。

圖1 電位滴定圖Fig.1 Potentiometric titration

根據(jù)酸堿中和推出計(jì)算公式：生物堿含量(%)=[(CH2SO4×VH2SO4×2-CNaOH×VNaOH)/樣品質(zhì)量]×M×100%， 即可求得生物堿的含量。

式中：CH2SO4為H2SO4濃度，mol/L；VH2SO4為H2SO4體積，L； CNaOH為NaOH濃度，mol/L；VNaOH為消耗NaOH的體積，L；M為花椒的生物堿(青花椒堿)相對(duì)分子量，257 g/mol。

由圖1可知，突躍點(diǎn)的NaOH消耗量為19.3 mL，則根據(jù)公式可以計(jì)算得：生物堿含量(%)=[(0.0193×0.02×2-0.0378×0.0193)/1]×257=1.09%。

因此，在料液比為1∶20，乙醇濃度為70%，提取溫度為60 ℃下提取3 h時(shí)的花椒中生物堿的含量為1.09%。

2.4 生物堿提取條件的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)

綜合對(duì)各種資料及文獻(xiàn)的參考及考慮，初步確定了影響花椒生物堿提取得率的4個(gè)重要因素，包括乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度。為了獲得每個(gè)因素的最佳工藝條件，必須先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，固定其中3個(gè)因素不變，然后適當(dāng)改變剩下1個(gè)因素的取值，在不同條件下進(jìn)行試驗(yàn)，并通過(guò)記錄數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，作圖計(jì)算出生物堿的提取得率。根據(jù)生物堿的不同提取得率，便可以得到每個(gè)因素的最佳條件，由于各提取條件對(duì)生物堿的提取得率都有很大的影響，為了測(cè)定每個(gè)因素單獨(dú)對(duì)提取得率的不同影響，進(jìn)行4組單因素試驗(yàn)。

2.4.1.1 提取溫度對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍體積的70%乙醇，在60，70，80，90 ℃不同溫度下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法測(cè)定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)，作圖比較。

圖2 提取溫度對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖2可知，在60～70 ℃之間隨著溫度的增加花椒中生物堿的提取得率也增加，但是超過(guò)70 ℃后花椒中生物堿的提取得率逐漸減少，尤其在80 ℃后提取得率明顯降低。所以確定選用60，70，80 ℃作為正交試驗(yàn)的該因素3個(gè)水平。

2.4.1.2 乙醇濃度對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍體積濃度為60%，70%，80%，90%的乙醇，分別在70 ℃下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法測(cè)定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)，作圖比較。

圖3 乙醇濃度對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響Fig.3 Effect of different ethanol concentration on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖3可知，乙醇濃度對(duì)花椒總生物堿的提取率影響顯著。乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低總生物堿的提取得率都會(huì)降低，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率可高達(dá)1.61%，因此選擇70%，80%，90%乙醇作為正交試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)的3個(gè)水平。

2.4.1.3 提取時(shí)間對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍體積70%的乙醇，在70 ℃下分別提取1.5，2，2.5，3 h，取出提取液，按照2.2.3方法測(cè)定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)， 作圖比較。

圖4 提取時(shí)間對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖4可知，提取時(shí)間延長(zhǎng)生物堿的提取得率增大，最大可達(dá)1.70%，因?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取過(guò)程中提取時(shí)間的正確掌控對(duì)提取效果有重要影響，溶出平衡之前，隨時(shí)間延長(zhǎng)溶出率增大。

2.4.1.4 料液比對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，分別加入10，20，30，40倍體積的70%乙醇，在70 ℃下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法測(cè)定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)，作圖比較。

圖5 料液比對(duì)花椒中生物堿提取得率的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖5可知，隨料液比的增大總生物堿的提取得率也增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)提取得率可高達(dá)1.61%，料液比為1∶20與1∶30的提取得率差異不大，說(shuō)明1∶30的料液比就可以把生物堿基本提取完全。并且考慮到溶劑用量大、回收困難、節(jié)省成本的因素，因此選擇1∶10，1∶20，1∶30的料液比作為正交試驗(yàn)料液比因素的3個(gè)水平。

2.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)以下正交試驗(yàn)。分別稱取1 g花椒9份，加入到已編號(hào)的9支250 mL三角瓶中，按照四因素三水平進(jìn)行添加及條件控制。按照2.3.2方法測(cè)定生物堿的含量，記錄數(shù)據(jù)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表3可知，最佳提取條件為B1A2C3D1，即在料液比為1∶10、乙醇濃度為80%、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為3 h的條件下，對(duì)花椒的提取率最大，由極差分析可以看出，料液比為影響提取得率的重要因素，而提取溫度影響最小。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)正交試驗(yàn)得到了生物堿的最優(yōu)工藝，為了驗(yàn)證最優(yōu)組合的正確性，試驗(yàn)在得到的最佳提取組合條件下，即在提取溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取時(shí)間3 h，料液比為1∶10的條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，驗(yàn)證試驗(yàn)的平均提取率為2.11%，與7號(hào)組合基本一致，說(shuō)明了優(yōu)化試驗(yàn)的合理性。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification experiment

4 結(jié)論

本研究采用熱浸提法提取花椒中的生物堿，并通過(guò)電位滴定法測(cè)定生物堿的含量。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了影響生物堿提取得率因素的主次順序，以及各項(xiàng)因素的最佳條件，并最終確定了提取的最佳工藝。通過(guò)正交試驗(yàn)，生物堿的最佳提取條件為乙醇濃度80%、料液比1∶10、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間3 h，在此條件下花椒中生物堿提取得率為2.11%。

通過(guò)對(duì)花椒中花色苷、生物堿的提取工藝進(jìn)行研究，可為花椒進(jìn)一步的藥理作用研究提供一定的理論依據(jù)。

[1]常志青.茵芋堿的鎮(zhèn)痛、解痙和鎮(zhèn)靜作用[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1982,30(3):163.

[2]劉雄,闞建全,陳宗道,等.花椒風(fēng)味成分的提取[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003,29(12):33-35.

[3]吳素蕊,闞建全,劉春芬.花椒的活性成分與應(yīng)用研究[J].中國(guó)食品添加劑，2004(2):75-78.

[4]楊純瑜.中國(guó)花椒屬的藥用植物[J].中草藥,1992,23(1):45.

[5]王寧,巨勇,王釗.花椒屬植物中生物活性成分研究近況[J].中草藥，2002,33(7)：121-122.

[6]關(guān)榮琴,石雪萍,張衛(wèi)明,等.不同品種花椒生物堿含量測(cè)定及光譜學(xué)特性分析[J].中國(guó)野生植物資源,2010,29(3):34-36.

[7]石雪萍,張宇思.酸性染料比色法測(cè)定花椒總生物堿的含量[J].中國(guó)野生植物資源,2008,27(6):62.

[8]華茉莉,李定祥,姜仁吉.自動(dòng)電位滴定法測(cè)定金釵石斛藥材中總生物堿的含量[J].中成藥,2010,32(6):1004-1007.

[9]王汝平,石雪萍.花椒總生物堿的提取條件研究[J].食品科學(xué),2008,29(10):157-158.

[10]王曉琳.生物堿提取與純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2006,25(3):259-263.

[11]石雪萍,張宇.水溶性花椒生物堿和精油同時(shí)提取工藝研究[J].食品科學(xué),2009,30(10):188-190.

[12]石雪萍，汪洪濤,余芳,等.電位滴定法測(cè)定苦瓜中總生物堿的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013,39(5):190-193.

StudyonDeterminationMethodandExtractionTechnologyofZanthoxylumbungeanumAlkaloids

SHI Xue-ping

(School of Engineering and Technology,Jiangsu Vocational Institute of Commerce,Nanjing 210007,China)

The alkaloids are extracted by ethanol-water extraction and the content of alkaloids is determined by potentiometric titration. Through the single factor experiment, the optimum technological parameters for extracting alkaloids fromZanthoxylumbungeanumare determined, and the optimum extraction process is determined by orthogonal test.The results show that using the method of potentiometric titration, it is easy to find the titration end point. According to acid-base reaction, the content of alkaloid could be calculated. Using ethanol heating extraction method, the extraction technology of total alkaloids fromZanthoxylumbungeanumis studied by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum extraction conditions are:using 80% ethanol as extractant, material-liquid ratio is 1∶10, extraction temperature is 70 ℃, extraction time is 3 h.The optimum extraction rate of alkaloids by ethanol heating extraction method is 2.11%.

Zanthoxylumbungeanum;alkaloid;determination;extraction technology

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.022

1000-9973(2017)12-0101-05

2017-06-21

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(SBK201620404)

石雪萍(1974-)，女，河南南陽(yáng)人，副研究員，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)、功能性食品研究與開發(fā)。