石榴籽油總多酚含量測定方法的優化

申元福，趙琦，陳芳，謝貞建，周闖，姚倩，*

（1.成都大學四川抗菌素工業研究所，四川成都610106；2.成都大學藥學與生物工程學院，四川成都610106）

石榴籽油總多酚含量測定方法的優化

申元福1，2，趙琦2，陳芳2，謝貞建2，周闖2，姚倩2，*

（1.成都大學四川抗菌素工業研究所，四川成都610106；2.成都大學藥學與生物工程學院，四川成都610106）

對石榴籽油總多酚含量測定方法進行優化。考察提取溶劑、溶劑濃度和提取次數對石榴籽油總多酚提取效率的影響，同時以石榴籽中所含的3種多酚及油多酚提取液為研究對象，對測定方法的檢測波長、Folin-Ciocalteu試劑用量、碳酸鈉溶液用量、試劑加入的間隔時間和反應時間進行了優化。結果顯示：石榴籽油經80%乙醇提取3次后多酚可提取完全，優于常用的甲醇提取或經正己烷脫脂處理后的甲醇提取法。以沒食子酸為對照，優化后的顯色條件為：檢測波長765 nm，Folin試劑3.5 mL，7.5%的碳酸鈉溶液2.5 mL，試劑加入間隔時間5 min，顯色反應30 min。此條件下沒食子酸的高、中、低濃度平均回收率為（100.69±0.34）%；沒食子酸濃度在10 μg/mL～60 μg/mL范圍內，吸光度與濃度線性關系良好（r=0.999 1）；同一樣品重復測定6次的RSD為0.67%。

石榴籽油；多酚；提取；含量測定；顯色條件

在日常生活中，食品的儲存常常會加入化學合成抗氧化劑，但這類抗氧化劑的毒副作用較大[1]，因此選擇天然抗氧化劑是研究的熱點。植物多酚作為一種天然的抗氧化劑，是植物生長過程中體內多元酚類的次生代謝產物[2]。它是一類多羥基酚類化合物的總稱，主要由酚酸、黃酮、單寧、原花色素等組成[3]。研究表明，植物多酚具有抗動脈硬化、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等多種藥理作用[4-6]。

據文獻報道[7-9]，一些植物油中也常常含有大量的多酚物質，例如石榴籽油、橄欖油、葡萄籽油。由于多酚的存在，起到了對油脂氧化變質的保護作用，多酚也是植物油質量評價的一項重要指標[10-11]。目前對于植物油中總多酚的測定，常用的方法有直接測定[12-13]或經甲醇溶液提取后，采用Folin-Ciocalteu分光光度法檢測[14]；為進一步降低油中脂溶性成分對檢測的干擾，有文獻使用正己烷先行脫脂處理，再用甲醇提取[15-16]。檢測方法的優化集中在對Folin試劑反應條件的改進上[17]。本文選擇石榴籽油為研究對象，考察了石榴籽油多酚的提取條件，對多酚提取溶劑做了改進；針對常用的Folin試劑分光光度顯色法，以油多酚提取液及石榴籽中所含的3種多酚為考察對象，采用單因素法對顯色條件進行了優化，為植物油多酚含量的準確評價提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴籽油：西安普萊特生物工程有限公司；沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠，含量大于99.0%；兒茶素：深圳一諾食品配料有限公司，含量99.80%；咖啡酸：陜西森弗天然制品有限公司，含量99.0%；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

5100B型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SF-TGL-16M離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；VORTEX-5旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Folin試劑分光光度法

1.3.1.1 Folin-Ciocalteu試劑的制備[18]

取100 g鎢酸鈉和25 g鉬酸鈉，溶解在800 mL水中，隨后加入100 mL鹽酸與50 mL磷酸，回流10 h，冷卻后加入150 g硫酸鋰，50 mL水，及4滴～6滴溴水，放置2 h，溶液煮沸15 min，冷卻后濾過，溶液應無綠色。使用前用水稀釋10倍。

1.3.1.2 樣品溶液的制備

精確移取石榴籽油0.25 mL，分別加入0.5 mL乙醇溶液、甲醇溶液或先加入正己烷旋渦脫脂，再加入甲醇溶液，旋渦振蕩提取其中的總多酚，在8 000 r/min轉速下離心10 min，收集上清液，即得樣品溶液。

1.3.1.3 對照品溶液的制備

精確稱取沒食子酸、兒茶素和咖啡酸對照品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10mL，得到濃度為1mg/mL的儲備液。取沒食子酸、兒茶素和咖啡酸的儲備液，分別用甲醇稀釋制成濃度為30、120、25 μg/mL的溶液。

1.3.1.4 測定方法[18]

分別取對照品溶液及樣品溶液各0.5 mL，置試管中，加入2.5mL經稀釋的Folin-Ciocalteu試劑，及2.0mL濃度為7.5%的碳酸鈉溶液，加蓋，旋渦混勻，25℃下放置30 min，在10 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液，用紫外-可見分光光度計在760 nm波長處測定吸光度值A，根據標準曲線計算樣品中總多酚的含量，以 μg沒食子酸當量（Gallic acid equivalents，GAE）/mL，即μg GAE/mL表示。

1.3.2 總多酚提取條件的優化

1.3.2.1 提取溶劑的選擇

精確移取石榴籽油0.25 mL，分別選擇0.5 mL 80%乙醇和0.5 mL 80%甲醇提取3次，或先加入等體積正己烷脫脂，再使用0.5 mL 80%甲醇提取3次，合并提取液，按照“1.3.1.4”項下操作，測定總多酚的含量，確定提取溶劑。

1.3.2.2 提取溶劑濃度的選擇

精確移取石榴籽油0.25 mL，將確定的溶劑濃度設定為75%、80%、85%，提取3次，每次0.5 mL，合并提取液，按照“1.3.1.4”項下操作，測定總多酚的含量，確定提取溶劑濃度。

1.3.2.3 提取次數的選擇

精確移取石榴籽油0.25 mL，根據確定的溶劑進行提取，提取次數設定為 2、3、4 次，每次 0.5 mL，合并提取液，按照“1.3.1.4”項下操作，測定總多酚的含量，確定提取次數。

1.3.3 總多酚測定條件的優化

1.3.3.1 檢測波長的選擇

分別移取0.5 mL 3個多酚對照品和石榴籽油多酚提取液，按照“1.3.1.4”項下操作，用紫外可見分光光度計在600 nm～850 nm波長范圍內掃描，確定檢測波長。

1.3.3.2 Folin試劑用量的選擇

分別移取0.5 mL對照品和多酚提取溶液，分別加入 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL Folin 試劑，及 2.0 mL 濃度為7.5%Na2CO3溶液，旋渦混勻，25℃下放置30 min，用蒸餾水稀釋至10 mL，在檢測波長處測定吸光度，確定Folin試劑的用量。

1.3.3.3 Na2CO3溶液用量的選擇

分別移取0.5 mL對照品和多酚提取溶液，加入選定用量的Folin試劑，再分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，其余操作同上，確定7.5%Na2CO3溶液的用量。

1.3.3.4 間隔時間的選擇

分別移取0.5 mL對照品和多酚提取溶液，加入選定用量的 Folin 試劑，分別放置 0、3、5、10、15 min后，再加入選定用量的Na2CO3溶液，其余操作同上，確定試劑加入的間隔時間。

1.3.3.5 反應時間的選擇

在確定的條件下，將反應時間設為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余操作同上，確定最佳反應時間。

1.3.4 測定方法的考察

以沒食子酸為對照計算總多酚含量，對方法進行線性關系、準確性等考察。

1.3.4.1 線性關系

精確移取沒食子酸儲備液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，用甲醇稀釋成濃度為 10、20、30、40、50、60μg/mL的溶液。按照“1.3.3”中優化的條件下操作，反應結束后，用蒸餾水定容至10 mL，以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4.2 回收率

精確移取3份多酚濃度已知的石榴籽油，分別加入沒食子酸對照品 22.5、12.0、8.0 μg，用 0.5 mL 80%的乙醇提取3次，合并提取液，按優化后的顯色條件試驗，并推算出對照品含量，與實際加入量作比較，計算沒食子酸高、中、低濃度的回收率。

1.3.4.3 重復性

精確移取 6份石榴籽油，按照“1.3.2”和“1.3.3”中優化的條件下操作，測定石榴籽油總多酚含量，考察測定方法的重復性。

1.3.4.4 穩定性

取石榴籽油提取液及濃度為30 μg/mL沒食子酸對照品溶液，按照“1.3.3”中優化的條件下操作，避光放置 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，測定吸光度，考察方法的穩定性。

1.3.5 樣品的測定

取市售的3個不同廠家的石榴籽油，采用優化后的提取與顯色條件測定油中的總多酚。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化結果

2.1.1 提取溶劑的選擇

在試驗過程中發現，用無水乙醇或純甲醇提取時，提取液中含有較多的脂溶性成分，檢測中加入碳酸鈉溶液時易變渾濁，不利于多酚的測定；用低濃度的乙醇或甲醇溶液提取時，提取效果明顯下降，使得提取次數增多，加大了溶劑的用量和操作時間。因此，試驗考察了80%乙醇和80%甲醇兩種溶劑對石榴籽油中多酚的提取效果，測得的多酚含量見圖1。

圖1 提取溶劑對總多酚含量測定的影響Fig.1 The effect of extraction solvent on the determination of total polyphenols

如圖1所示，以80%乙醇溶液提取為最高，正己烷脫脂-80%甲醇提取的總多酚略高于甲醇，而脫脂后的樣品仍然需經離心處理，否則溶液為混濁狀態，不能用光度法檢測。可見，正己烷脫脂對提高檢測用樣品澄清度無明顯作用。

2.1.2 提取溶劑濃度的選擇

考察75%、80%和85%3個乙醇濃度對石榴籽油中總多酚提取的影響。溶劑濃度對總多酚含量測定的影響見圖2。

圖2 溶劑濃度對總多酚含量測定的影響Fig.2 The effect of solvent concentration on the determination of total polyphenols

如圖2所示，用80%乙醇的提取效果明顯好于用75%乙醇提取；當乙醇體積分數為85%時，其提取能力比80%乙醇略高一點，但檢測溶液的濁度明顯增加，影響測定結果。因此，在提取效果相差不大時，宜選擇含水量較大的溶劑提取，避免渾濁現象的發生。故選用80%乙醇提取。

2.1.3 提取次數的選擇

提取次數對總多酚含量測定的影響見圖3。

如圖3所示，隨著提取次數的增加，總多酚的含量也隨之增加。在提取3次后，其總多酚含量的增加程度不明顯。故選擇提取次數為3次。

圖3 提取次數對總多酚含量測定的影響Fig.3 The effect of extraction times on the determination of total polyphenols

2.2 總多酚測定條件的優化結果

2.2.1 檢測波長的選擇

樣品和多酚溶液的波長掃描結果見圖4。

圖4 樣品和多酚溶液的波長掃描結果Fig.4 Scanning spectrums of the sample and polyphenol solutions after reacting with Folin－Ciocalteu reagent

如圖4所示，樣品和3種多酚溶液均在765 nm處有最大吸收峰，故選765 nm作為檢測波長。

2.2.2 Folin試劑用量的選擇

Folin－Ciocalteu用量對總多酚含量測定的影響見圖5。

圖5 Folin－Ciocalteu用量對總多酚含量測定的影響Fig.5 The effect of Folin－Ciocalteu amount on the determination of total polyphenols

如圖5所示，當Folin試劑用量為2.5 mL時，兒茶素和咖啡酸的反應體系中出現渾濁現象，導致測定結果偏高。3種多酚表現出了相同的趨勢，即當試劑用量增加到3.5 mL時，其吸光度值達到最大，此時溶液為藍色。繼續增加Folin試劑體積，試劑本身的顏色將掩蓋反應溶液的顏色，導致吸光度值下降。樣品溶液的變化趨勢與多酚對照品溶液有所不同，吸光度隨Folin試劑用量的增加而增加，無下降的情況發生，當用量為3.5 mL時，其吸光度值達到拐點，此時再增加試劑體積，吸光度值增大不明顯，說明Folin試劑與混合多酚及單一多酚的反應存在差異。因此Folin試劑的用量選擇為3.5 mL。

2.2.3 Na2CO3用量的選擇

7.5 %碳酸鈉用量對總多酚含量測定的影響見圖6。

圖6 7.5%碳酸鈉用量對總多酚含量測定的影響Fig.6 The effect of 7.5%of the sodium carbonate amount on the determination of total polyphenols

如圖6所示，隨著7.5%Na2CO3的用量增加，樣品和3種多酚溶液的吸光度值也增加，當Na2CO3的用量為2.5 mL時，3種對照品溶液的吸光度值達到最大。樣品溶液在Na2CO3的用量為2.0 mL時，其吸光度達到最大，繼續增加Na2CO3的用量到2.5 mL，其吸光度值略有下降，但不明顯。因此選擇7.5%Na2CO3的用量為2.5 mL。

2.2.4 間隔時間的選擇

間隔時間對總多酚含量測定的影響見圖7。

如圖7所示，隨著Folin試劑與Na2CO3溶液加入間隔時間的延長，樣品和3種多酚溶液的吸光度值增加，當間隔時間為5 min時，吸光度值達到平衡。因此試劑加入的間隔時間為5 min。

2.2.5 反應時間的選擇

反應時間對總多酚含量測定的影響見如8。

如圖8所示，樣品、沒食子酸的反應時間為30 min時，吸光度值達最大，繼續增加反應時間，吸光度保持恒定；咖啡酸反應時間為1 h，兒茶素需經1.5 h的反應才可使吸光度值達到最大，繼續延長反應時間，吸光度值開始下降。反應時間與酚羥基的位置與數量相關，沒食子酸含3個相鄰的酚羥基，反應速度相對較快；咖啡酸含2個相鄰的酚羥基，反應時間延長；兒茶素有4個酚羥基，2個相鄰，另2個處于間位，反應速度進一步減慢。若以沒食子酸為對照計算樣品中總多酚的含量，反應時間可控制在30 min。

圖7 間隔時間對總多酚含量測定的影響Fig.7 The effect of interval time on the determination of total polyphenols

圖8 反應時間對總多酚含量測定的影響Fig.8 The effect of reaction time on the determination of total polyphenol

2.3 方法學考察結果

2.3.1 線性范圍

吸光度值與沒食子酸濃度的回歸方程：A=0.0077C+0.035 1（r=0.999 1）。可見，沒食子酸在 10 μg/mL～60 μg/mL濃度范圍內，與吸光度的線性關系良好。

2.3.2 回收率試驗

回收率試驗結果見表1。

表1 回收率試驗結果Table 1 The results of recovery test

由表1可知，平均回收率為100.69%，RSD為0.34%，表明該方法的準確性較高。

2.3.3 重復性試驗

同一批次石榴籽油重復測定6次，總多酚的平均含量為 188.28 μg GAE/mL，RSD 為 0.67%，RSD 小于1.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗

穩定性試驗結果見表2。

表2 穩定性試驗結果Table 2 The result of stability test

由表2可知，樣品溶液和濃度為30 μg/mL的沒食子酸對照品溶液按照“1.3.3”中優化的條件試驗，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，RSD均小于0.5%，表明該方法穩定。

2.4 樣品的測定

以沒食子酸為對照，采用所建立的方法分別測定了來自3個不同產地的石榴籽油中總多酚的含量，結果見表3。

表3 不同產地石榴籽油總多酚含量Table 3 Total polyphenols in pomegranate seed oils from different sources

3 結論

本文選擇80%乙醇提取石榴籽油中的總多酚，并與文獻報道的采用甲醇提取或先用正己烷對植物油進行脫脂處理，再加甲醇提取方法進行了比較，試驗發現采用80%乙醇提取石榴籽油中總多酚，經3次提取后，總多酚提取效率為最高；此外，以石榴籽油多酚提取物和石榴籽中所含的3種多酚為考察對象，對Folin試劑分光光度顯色條件進行了優化，優化后沒食子酸平均回收率為（100.69±0.34）%。本法簡便、準確、穩定，值得推廣應用。

[1]劉暢,周家春.植物多酚抗氧化性研究[J].糧食與油脂,2011(2):43-46

[2]陳亮,李醫明,陳凱先,等.植物多酚類成分提取分離研究進展[J].中草藥,2013,44(11):1501-1507

[3]尤新.植物多酚黃酮抗氧化劑與人體健康[J].食品與生物技術學報,2011,30(4):481-488

[4]FANTINI M,BENVENUTO M,MASUELLI L,et al.In vitro and in vivo antitumoral effects of combinations of polyphenols,or polyphenols and anticancer drugs:perspectives on cancer treatment[J].Int J Mol Sci,2015,16(5):9236-9282

[5]ZOU D,XIE A.Influence of polyphenol-plasma protein interaction on the antioxidant properties of polyphenols[J].Curr Drug Metab,2013,14(4):451-455

[6]LIU C W,WANG Y C,LU H C,et al.Optimization of ultrasoundassisted extraction conditions for total phenols with anti-hyperglycemic activity from Psidium guajava leaves[J].Process Biochem,2014,49(10):1601-1605

[7]李勇.石榴籽油冷榨技術及活性成分生理作用研究[J].中國食物與營養,2011,17(2):38-41

[8]PERES F,MARTINS L L,MOURATO M,et al.Phenolic compounds of'Galega Vulgar'and'Cobran?osa'olive oils along early ripening stages[J].Food Chem,2016,211(15):51-58

[9]BAIL S,STUEBIGER G,KRIST S,et al.Characterisation of various grape seed oils by volatile compounds,triacylglcerol composition,total phenols and antioxidant capacity[J].Food Chem,2008,108(3):1122-1132

[10]MARFIL R,GIMENEZ R,MARTINEZ O,et al.Determination of polyphenols,tocopherols,and antioxidant capacity in virgin argan oil(Argania spinosa,Skeels)[J].Eur J Lipid Sci Tech,2011,113(7):886-893

[11]ARRANZ S,CERT R,PEREZ-JIMENEZ J,et al.Comparison between free radical scavenging capacity and oxidative stability of nut oils[J].Food Chem,2008,110(4):985-990

[12]HOSSAIN M A,SHAH M D,GNANARAJ C,et al.In vitro total phenolics,flavonoids contents and antioxidant activity of essential oil,various organic extracts from the leaves of tropical medicinal plant Tetrastigma from Sabah[J].Asian Pac J Trop Med,2011,4(9):717-721

[13]HAQUE A S M T,JIN N M,SARAVANA P S,et al.Composition of Asarum heterotropoides var.mandshuricum radix oil from different extraction methods and activities against human body odor-producing bacteria[J].J Food Drug Anal,2016,24(4):813-821

[14]SEIQUER I,RUEDA A,OLALLA M,et al.Assessing the bioavailability of polyphenols and antioxidant properties of extra virgin argan oil by simulated digestion and Caco-2 cell assays.Comparative study with extra virgin olive oil[J].Food Chem,2015,188(1):496-503

[15]APETREI I M,APETREI C.Voltammetric e-tongue for the quantification of total polyphenol content in olive oils[J].Food Res Int,2013,54(2):2075-2082

[16]PARADISO V M,CLEMENTE A,SUMMO C,et al.Towards green analysis of virgin olive oil phenolic compounds:Extraction by a natural deep eutectic solvent and direct spectrophotometric detection[J].Food Chem,2016(1),212:43-47

[17]徐佳,辛立方,張瑞廷,等.改良的Folin-Ciocalteu比色法測定核桃外果皮中總多酚含量[J].食品工業科技,2012,33(6):60-63

[18]EIDI A,MOGHADAM J Z,MORTAZAVI P,et al.Hepatoprotective effects of Juglans regia extract against CCl(4)-induced oxidative damage in rats[J].Pharm Biol,2013,51(5):558-565

Method Optimization for the Determination of Total Polyphenols in Pomegranate Seed Oil

SHEN Yuan-fu1，2，ZHAO Qi2，CHEN Fang2，XIE Zhen-jian2，ZHOU Chuang2，YAO Qian2，*
（1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China；2.School of Pharmacy and Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

The method for the determination of total polyphenols in pomegranate seed oil was optimized in this study.The effects of extraction solvents，solvent concentration and extraction times on the extract efficiency of total polyphenols from pomegranate seed oil were examined.Meanwhile，the assay conditions，including detection wavelength，the amounts of Folin-Ciocalteu reagent and sodium carbonate solution，the interval time for the reagent addition，and the reaction time，were screened for three polyphenols in pomegranate seeds and the phenol extract from the oil，respectively.The results showed that total polyphenols in the oil was recovered completely by being extracted with 80%ethanol for three times.The extract efficiency was higher than the commonly used methods，either extraction with methanol or being defatted with hexane followed by methanol extraction.Based on the control of gallic acid，the chromogenic conditions were optimized as followed：detection at 765 nm，3.5mLofFolin-Ciocalteureagent，2.5mLof7.5%sodiumcarbonatesolution，5minofintervaltimeforthereagent addition，30 min of reaction time at 25℃.Under such conditions，the mean recovery of gallic acid at low，medium，and high concentrations was（100.69±0.34）%.The absorbance was linear with the gallic acid concentration intherangeof10μg/mLto60μg/mL（r=0.9991）.TheRSDofsix-timeassaysforthesamesamplewas0.67%.

pomegranate seed oil；polyphenol；extract；determination；chromogenic conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.023

四川省教育廳重點項目（16ZA0390）；教育部留學回國人員科研啟動基金（20131792）

申元福（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：藥食同源植物提取與產品開發。

*通信作者：姚倩（1971—），女（漢），教授，博士，研究方向：藥食同源植物有效部位的篩選與產品開發。

2017-04-19