酶聯免疫吸附試驗對乙型肝炎表面抗原陰性獻血者核酸篩查及降低輸血傳播乙型肝炎病毒效果分析

馬艷華

（河南省周口市中心血站，河南 周口 466000）

·經驗交流·

酶聯免疫吸附試驗對乙型肝炎表面抗原陰性獻血者核酸篩查及降低輸血傳播乙型肝炎病毒效果分析

馬艷華

（河南省周口市中心血站，河南 周口 466000）

目的了解本地區酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測乙肝表面抗原（HBsAg）結果呈陰性獻血者經核酸檢測技術（NAT）復檢情況及對降低輸血傳播乙型肝炎病毒（HBV）的效果。方法應用兩種不同廠家ELISA檢測試劑對36 459 例獻血者標本進行HBsAg篩查，ELISA檢測結果呈陰性標本應用上海浩源血液篩查系統行核酸檢測，對NAT結果為陽性的標本行乙肝兩對半檢測。結果采用ELISA法檢測36 459例標本中，HBsAg陽性112例；36 347例陰性樣本經NAT檢測，檢出陽性39例，陽性檢出率為0.11%；39例陽性患者中成功隨訪9例，其中乙型肝炎窗口期感染2例，隱匿性感染7例。結論血站應用ELISA聯合NAT開展血液篩查檢測,能有效降低HBV經輸血傳播的風險，提高血液安全性。

無償獻血者；NAT檢測；HBV-DNA；血液篩查

乙型肝炎及乙肝病毒攜帶者在我國廣泛流行，嚴重危害人民健康，且感染率較高，我國屬于乙肝高發區。90年代初我國已將新生兒乙肝疫苗接種納入計劃免疫及無償獻血制度等綜合措施中，人群中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）的流行率大幅下降[1]，但輸血感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）也不容忽視。越來越多的研究發現，酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）檢測存在一定局限性，核酸檢測技術（nucleic acid testing,NAT）具有高度的敏感性和特異性，可明顯縮短病毒檢測窗口期，提高血液安全性[2]。本文對36 347例ELISA篩查結果呈陰性標本再進行NAT檢測，具體內容報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取河南省周口市中心血站2016年1月1 日‐2017年2月30日采集的無償獻血者標本36 459例為研究對象，其中，男17 995例，女18 464例；年齡18～55歲，中位年齡31.46歲。所有獻血者符合《獻血者健康檢查要求》，檢查項目均經本站倫理委員會的批準，獻血者均簽署自愿獻血協議。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA初檢、復檢試劑分別由珠海麗珠生物科技有限公司、上海科華生物技術有限公司提供，HBV/HCV/HIV三聯合核酸提取試劑和檢測試劑由上海浩源診斷公司提供。HBsAg ELISA陽性質控物、NAT檢測均由康徹思坦生物技術有限公司提供提供，HBsAg濃度為0.5 IU/ml，乙肝病毒的脫氧核糖核酸（HBV-DNA）靶值為2.3 IU/ ml，質控物和檢測試劑均批檢合格并在有效期內使用；費米（FAMA）全自動酶免分析檢測系統，由瑞士哈密爾頓公司生產；ChiTas 1200核酸血液篩查系統由上海浩源生物科技有限公司提供。所有檢測設備均能良好運行，并且廠家校驗均合格。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測 所有無償獻血者的標本均使用兩種不同廠家的ELISA試劑檢測，每批實驗需有空白對照孔、陰性對照孔、陽性對照孔和室內質控孔完成HBsAg檢測；ELISA法檢測以樣本孔吸光度值/臨界值（S/CO）比值判定檢測結果，S/ CO≥1.0為陽性，0.7≤S/CO＜1.0為灰區，S/ CO＜0.7為陰性。

1.3.2 核酸檢測技術（NAT）每8個標本混為一個混樣池，且均設定內標對照，將混樣所測定陰性為陰性結果，將混樣所測定陽性予以拆分檢測，拆分后陰性者判為陰性結果，拆分后陽性者判為陽性結果。

2 結果

2.1 兩種檢測方法對研究對象檢測結果顯示

36 459例無償獻血者經過ELISA篩查，HBsAg陽性樣本112例，陽性率為0.31%；ELISA篩查HBsAg呈陰性的36 347例樣本中，經NAT檢測，39例呈陽性，陽性率為0.11%。見表1。

2.2 HBV-DNA陽性標本乙肝兩對半檢測結果

39例HBV-DNA陽性的標本進行乙型肝炎病毒兩對半的ELISA檢測，結果顯示，抗-HBc（+）27例（69.23%）；抗-HBe（+）12例（30.77%）；抗-HBc和抗-Hbe同時陽性9例（23.08%）；全陰性5例（12.82%）。見表2。

2.3 隨訪結果

39例HBV核酸陽性的無償獻血者中，9位獻血者在獻血3個月后進行隨訪，9例全為HBVDNA陽性，其中5例ELISA乙肝兩對半全陰性標本中檢測出HBV-DNA陽性2例，證明9例NAT檢測HBV-DNA陽性標本中2例為窗口期感染，7 例為隱匿性感染。

表1 兩種檢測方法對研究對象檢測結果顯示

表2 HBsAg陽性HBV-DNA陽性乙肝兩對半檢測結果

3 討論

乙型肝炎是一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，由于影響因素居多，目前尚未發現有效的治愈方法。血液及血液制品感染是乙肝病毒感染的主要途徑之一，雖然HBsAg ELISA試劑盒檢測技術不斷改進，且血站對HBsAg采用不同廠家兩種試劑進行檢測，可將輸血感染乙肝的風險降到較低水平，但乙肝病毒感染窗口期血樣因ELISA無法檢出而造成漏檢，NAT具有較高的靈敏度和特異性，可檢出血液中較低水平的HBV感染，采用NAT可將窗口期縮短至20天[3]，因此，血站開展血液HBV NAT檢測尤為必要。NAT和ELISA檢測在方法學和臨床血液安全上各具特色，兩種技術存在良好的互補性[4]。NAT的主要原理是使用物理、化學和生物學方法，通過靶核酸直接擴增或其附帶信號擴增的方法，讓極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號，從而判斷標本中是否存在相應的病原體，包括核酸提取、擴增和檢測。

目前，磁珠（免疫磁珠）法是較常用方法，它是一種新型的免疫學技術，在免疫學檢驗、細胞分離以及核酸提取等方面應用較為廣泛。該方法操作簡便、易于自動化，對核酸標本的回收率較高及純度較好等優勢[5]。聚合酶鏈式反應是一種靈敏度高并且適用于大批量標本篩查的核酸擴增技術，其主要原理為，變性--退火--延伸3步驟，即按照模板DNA序列，在DNA聚合酶的催化下，用4種dNTP來合成與模板DNA完全相同的拷貝，從而在多種DNA分子混合物中特異擴增某一特定的DNA片段[6]。

我國是乙肝高發區，研究發現HBV血清轉換前窗口期（window phase,WP）與隱匿性乙肝病毒感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）獻血者是導致HBsAg篩查后輸血傳播感染HBV殘余風險的主要原因[7]。HBV WP與OBI感染的獻血者均為血清HBsAg陰性、HBV-DNA陽性；HBV WP獻血者HBsAg會隨著時間推移由陰性轉換為陽性，而OBI獻血者其HBsAg一般不會轉換為陽性，通常伴隨抗-HBc陽性，有的在低滴度抗-HBs獻血者中也會存在[8]。

本研究中，對36 347例兩遍ELISA檢測HBsAg陰性的標本中，使用上海浩源ChiTas 1200核酸檢測技術篩查出39例（0.11%）HBV-DNA陽性，即本地區無償獻血者經ELISA初篩HBsAg后HBV的殘余風險為0.11%，高于文獻報道蘇州地區的0.058%[9]、廈門地區的0.09%[10]。提示本地區經過ELISA初篩HBsAg后輸血傳播HBV的風險應引起足夠重視，NAT對于確保輸血安全，降低經血液傳播HBV的殘余風險具有積極意義。

此外，本文表2乙肝兩對半檢測結果顯示，39例HBV-DNA陽性標本存在HBsAb、HBeAb、HBcAb單項或合并陽性，其中抗-HBc陽性率最高（69.23%），表明患者輸注這部分獻血者捐獻的血液存在感染HBV風險。本文結果表明，隱匿性感染是導致獻血者經血傳播HBV的重要因素，病毒變異引起的隱匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）占有大部分，由隱匿性感染獻血者提供血液傳播HBV風險是窗口期的18.5倍（37/2）。OBI與HBV基因變異、病毒復制、表達水平過低或宿主免疫力方面等因素有關[10]。研究顯示，多數OBI感染者血循環中HBV-DNA的拷貝數較低，一般小于105 copies/ml，OBI可有多種臨床形式，可以是肝功能正常、HBsAg陰性的健康人，也可以在慢性HBV感染者自發或使用抗病毒藥物后出現[9]。有文獻報道，在無償獻血者人群中存在HBsAg和HBeAg陰性而抗-HBc陽性的模式，說明其HBV的漏檢不是免疫窗口期所致，可能是HBVS基因變異導致HBV低水平的復制，也可能是HBsAg陰性的隱匿性乙型肝炎感染[11]，因此，對乙型肝炎隱匿性感染的獻血者更應給予足夠重視。

綜上所述，對于開展核酸檢測技術的血站，在常規進行ELISA以及不斷提高血清學試劑盒靈敏度的同時，采用ELISA結合NAT篩查血液，能有效降低HBV經輸血傳播的風險，提高血液安全 性。

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R446.6

B

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.013

2017-07-28

（劉東京 編輯）