miR-124對皮層神經細胞活力的影響

劉得水，趙阿勐，趙麗暉，王 娜，，何志磊，梁雪梅?

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

·基礎研究·

miR-124對皮層神經細胞活力的影響

劉得水2，趙阿勐2，趙麗暉1，王 娜1，2，何志磊2，梁雪梅1?

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的探討miR-124對原代培養乳鼠的皮層神經細胞活力的影響。方法原代培養乳鼠皮質神經細胞，轉染miR-124或anti-miR-124并設定對照實驗，采用LDH試劑盒分別測定1 h，3 h，6 h，12 h，24 h的LDH釋放率和神經活力。結果過表達miR-124后的神經細胞LDH釋放率顯著低于對照組，而且神經細胞活力顯著高于對照組神經細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論miR-124可以減少神經細胞損傷，發揮神經保護作用。

MiR-124；神經細胞；神經保護

microRNA（miRNA）是一類長度約為21～23個核苷酸構成的調控性小RNA分子，它可以通過堿基配對的方式結合到靶基因mRNA 3'非翻譯區（3'UTR），從而對靶基因進行負性調控[1]。miRNA不僅影響著機體的正常生命活動，而且參與疾病發生的病理過程[2-3]。miRNA在機體的表達具有組織特異性，因此對靶基因的轉錄后水平調控也具有針對性[4]。神經組織當中也具有豐富miRNA，并對神經突觸可塑性發揮著重要的作用。大腦miR-124表達異常與多種神經精神系統疾病相關[5]。本項目為揭示miR-124在神經系統中所發揮作用，采用原代培養腦皮質神經細胞并通過miR-124和其抑制劑anti-miR-124進行干擾，觀察其對皮層神經細胞活力的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

購買于大連醫科大學實驗動物醫學部的9周齡SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠，經雌雄合籠獲得子代新生24 h的SD乳鼠。

1.1.1 試劑

DMEM/F12培養基（Hyclone公司）；滅活胎牛血清（Hyclone）；miR-124 mimics，mimics control，anti-miR-124 inhibitor，anti-miRNA control（Ambion公司）；LDH試劑盒（Andy Bio公司）。

1.1.2 儀器

酶標儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養皮質神經細胞及鑒定

新生24 h SD乳鼠，剝離皮質，剪碎，800轉/min*3離心棄上清，消化。加入含胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，過濾，離心棄上清。加入培液混勻，置于37℃含5% CO2的培養箱內培養。培養24 h后，換成含神經營養因子的培養液進行培養。72 h后，加入阿糖胞苷，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 分組

按照不同的處理分為pre-miRNA control，premiR-124，anti-miRNA control，anti-miR-124，共4組，同時設三組平行對照。

1.2.3 轉染

接種2×105/mL個神經細胞接種至6孔板中。細胞密度長至60～70%融合度時進行轉染。配置溶液Opti-MEM培養基+ Lipofectamine 2000溶液，Opti-MEM培養基稀釋pre-miRNA control/pre-miR-124或anti-miRNA control/anti-miR-124，二者輕輕混勻，室溫放置20 min。棄培液，加入Opti-MEM培養基，并將上述混合液加入培養液中。6 h后換液，置37℃含5% CO2的培養箱內培養。

采用LDH試劑盒檢測LDH釋放率轉染24 h后，重新鋪96孔板，于1 h，3 h，6 h，12 h，24 h檢測神經細胞LDH釋放率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；計數資料采用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-124及其抑制劑anti-miR-124對神經細胞LDH釋放率的影響

結果顯示，與對照組比較，體外轉染miR-124的神經細胞LDH釋放率降低，而轉染anti-miR-124顯著提高了神經細胞的LDH釋放率，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見圖1）。

圖1 miR-124和anti-miR-24對神經細胞LDH釋放率的影響（n=3，±s）

3 討 論

miRNA是普遍存在于生物體內一類小RNA，它具有非常廣的調控作用[2]。在哺乳動物的神經細胞中也存在大量的miRNAs，它們對于神經分化和神經突觸可塑性具有相當重要的作用，從而影響機體的學習與記憶等神經系統功能[3]。

在顳葉癲癇患者和動物模型腦組織中miR-124的表達均降低，這些改變提示miR-124可能參與癲癇的發生和形成過程[6]。在帕金森病中，多巴胺能神經元的miR-124通過調控AMPK/mTOR通路調節神經的細胞凋亡和自噬和保護[7]，提高腦的修復功能[8]。

本項目采用LDH試劑盒檢測經miR-124及其抑制劑anti-miR-124對神經細胞LDH釋放率的影響。LDH釋放率越高，表明細胞損傷越重。隨著轉染時間的延長，miR-124能夠延緩神經細胞的LDH的釋放率上升，提示其可能對神經細胞具有保護作用。而給予miR-124抑制劑anti-miR-124顯著提高了LDH的釋放率，提示其可能對神經細胞具有損傷作用。本研究進一步解釋了miR-124在神經系統的功能中可能發揮重要的作用。但是miR-124表達異常在疾病發生中的作用還有待今后通過不同的動物和細胞模型及不同的分子生物學方法進一步驗證。

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[7] Gong X,Wang H,Ye Y,et al.miR-124 regulates cell apoptosis and autophagy in dopaminergic neurons and protects them by regulating AMPK/mTOR pathway in Parkinson's disease[J].Am J Transl Res,2016,8(5):2127-2137.

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R749.94

B

ISSN.2095-8242.2017.067.13092.02

齊齊哈爾市科學技術計劃項目（No.SFGG-201529）

梁雪梅

本文編輯：趙小龍