16S rRNA序列分析法在醫學微生物鑒定中的應用研究

張玲玲

（鄭州工業應用技術學院，河南鄭州 450000）

16S rRNA序列分析法在醫學微生物鑒定中的應用研究

張玲玲

（鄭州工業應用技術學院，河南鄭州 450000）

目的：研究16SrRNA序列分析法在醫學微生物鑒定中的應用效果。方法：抽取2016年1月至2017年1月我院收治的肺炎患者38例作為研究對象，所有患者均采用16S rRNA和傳統微生物鑒定方式，以血清檢測結果作為金標準，比較兩種檢測方式在醫學微生物鑒定中的應用效果。結果：38例患者中檢測出肺炎支原體37（97.3%），16S rRNA序列分析法的在醫學微生物鑒定中，靈敏度92.1%，高于傳統微生物檢測72.8%，假陽性率7.9%，低于傳統微生物檢測34.2%，且檢測時間比傳統微生物檢測短，與傳統微生物檢測比較存在顯著差異（P＜0.05）。結論：16S rRNA序列分析法在醫學微生物檢測中效果顯著，檢測準確率高，具有應用價值。

16Sr RNA；序列分析法；醫學微生物鑒定

醫學微生物是與人類疾病有關的病原微生物，通過對醫學微生物的研究，能夠對人體感染疾病和致病機制、特異性診斷起到預防和治療的作用[1]，進而控制感染性疾病的發生，因此，醫學微生物的鑒定具有重要的意義。傳統的醫學微生物鑒定是在對細菌進行分離培養的基礎上，根據細菌的形態、生理生化反應、免疫學特征進行的[2]。隨著分子生物學研究的深入，各項檢驗技術的發展，對于微生物鑒定，已經從表型特征向基因特征深入，在鑒定的技術上，已經提高到鑒定細胞分子的水平上。16S rRNA等基因是rRNA基因序列作為生物系統的發育指標，這些基因參與了細菌蛋白質的合成，而且在大小上，16S rRNA的直徑要小于真核生物的相應rRNA，因此，能夠在微生物的鑒定中起到至關重要的作用[3]。本次對在醫學微生物鑒定中的應用16S rRNA序列分析法的效果進行了研究，效果分析具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2016年1月至2017年1月我院收治的肺炎患者38例作為研究對象，所有患者均進行16S rRNA和傳統微生物鑒定法，以血清檢測結果作為金標準。其中男性患者23例，女性患者15例，年齡14～74歲，平均年齡（50.7±4.1）歲。所有入選患者入院時均表現出頭痛、發熱，伴有無力、干咳等癥狀，胸部X線片顯示胸部云霧狀、扇狀游走性陰影。

1.2 方法

1.2.1 血清學檢查

所有患者均進行血清學檢查，在晨起空腹狀態下，抽取2mL靜脈血，抗凝，再經過離心處理。將得到的上清液進行稀釋處理，其與O型紅細胞在4℃下發生凝集情況，從而取得IgM抗體。再采用ELISA法，對血清中的MP-IgM進行檢測。

1.2.2 傳統微生物鑒定

提取患者痰液進行鑒定，提取后接種在含有胰酶消化液的培養基上，放在5%CO2，35℃環境中培養，在10～20d得到致密圓形菌群，在挑選可疑菌進行生化反應和藥敏實驗。

1.2.3 16S rRNA序列分析法鑒定

使用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，提取方法按照操作說明書進行。完成后進行擴增，引物取自肺炎支原體的16S rRNA，經過洗滌、離心等處理將獲得的模板進行變性退火、延伸循環擴增后的產物進行定性測定。

1.3 判斷標準

血清檢測判斷標準。支原體感染：MP-IgM≥1∶80，或冷凝集實驗≥1∶32。與患者的臨床表現癥狀，如發熱、頭痛、無力、干咳等相結合，判斷是否是肺炎支原體感染。

16S rRNA序列分析法判斷：根據肺炎支原體基因序列對比，以及患者是否伴有發熱、頭痛、無力、干咳等癥狀，判斷是否感染肺炎支原體。

傳統微生物鑒定判斷：標本中培養出肺炎支原體診斷肺炎支原體感染。

1.4 統計學分析

根據觀察指標統計相關數據，將有效數據輸入到SPSS18.0軟件中進行統計分析，進行T值和X2檢驗，當P值＜0.05時，組間比較具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清檢測判斷

38例患者中檢測出肺炎支原體37例，占97.3%。

2.2 兩種檢測法在醫學微生物鑒定中的應用比較

16SrRNA序列分析法的在醫學微生物鑒定中，靈敏度高，假陽性率低，檢測時間短，與傳統微生物檢測比較存在顯著差異（P＜0.05），見表1所示。

表1 兩種檢測法在醫學微生物鑒定中的應用比較

3 討論

醫學微生物鑒定方法有多種，傳統的微生物分裂是根據形態和生理對微生物進行培養，然后進行鑒定。目前，醫學界在微生物分裂鑒定方法上，主要有以下幾種，顯微鏡形態特征鑒定、細菌分離培養、免疫學和生化反應等，但以上幾種方法在鑒定后得到的結果容易被多種因素影響，特異性較差，敏感度較低，而且需要花費較多的時間鑒定[4]，從而對臨床檢驗醫學的發展產生了限制性。

科學進步使人們對分子遺傳學的研究不斷深入，帶動了分子生物學的發展，從20世紀60年代開始，微生物分類學就進入了分子生物學時期，廣泛應用在鑒定微生物中。至60年代末，在生物的分類上，Woese CR最先采用寡核苷酸編目法，其比較各種類型的生物細胞的核糖體RNA（rRNA）特征序列，得出結論是：16S rRNA及其類似的rRNA基因序列適合作為生物系統發育指標[5]。這是因為，16S rRNA是細胞共有的基因，具有同源的功能，不僅包括保守序列，也包括可變序列，分子大小適合操作，序列變化和進化距離相適應[6]。Woese提出的16S rRNA理論隨著科學的進步逐漸被認同，而且基因組也支持此研究結果，至此作為微生物分類系統的依據，16S rRNA序列分析法得到了廣泛的認同。在科學技術的不斷完善中，微生物核糖體數據庫逐漸充實完善，16S rRNA序列分析技術也成為了對細菌分類，鑒定細菌的有效方式[7]。

近年來，聚合酶鏈式反應（PCR）技術不斷發展，核酸技術及其他分子生物學技術的發展，使微生物的分類和鑒定有了新的方法，常見有限制性片段長度多肽性分析，PCR指紋圖，16S rRNA序列分析法等。上述新型的鑒定方均能夠分析微生物染色體，或分析染色體外的DNA片段，從分子遺傳學的角度鑒定微生物，并進行分類，從而使微生物的鑒定更加準確、科學。特別是16S rRNA序列分析法能夠對微生物是否進化進行研究分析，因此，在醫學微生物的鑒定中廣泛應用。

16S rRNA序列分析法對微生物的鑒定，原理是微生物染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有的微生物以及原核生物染色體基因中[8]，但在非原核生物中，如病毒、真菌等不存在。目前，對于所有病原菌16S rRNA基因測序已經完成，因此，在鑒定微生物種類中，可以使用基因序列圖譜對比分析，具有準確性高、鑒定快速的效果。

本次研究以我院收治肺炎患者為例，入選患者均采用16S rRNA和傳統微生物鑒定方式，以血清檢測結果作為金標準，比較兩種檢測方式在醫學微生物鑒定中的應用效果，結果發現，16S rRNA序列分析法的在醫學微生物鑒定中，靈敏度高，假陽性率低，檢測時間短，與傳統微生物檢測比較存在顯著差異，該方式的檢測結果與血清檢測結果更為接近，說明16S rRNA序列分析法檢測效果準確性高。

對16S rRNA序列分析法與傳統微生物鑒定法有以下幾點不同，一是16S rRNA序列分析法擺脫了微生物分離培養方式，對能夠快速的鑒定，即便是人工培養的微生物也能很快的鑒定；二是16S rRNA序列分析法的鑒定指標具有單一性、明確性的特點，以16S rRNA序列作為基礎，通過尋找序列之間的差異，對微生物種類屬性進行鑒定，能夠發現新的微生物種類，而傳統微生物鑒定較為復雜，需要結合大量的指標才能確定，而且常規的PCR檢測也必須是已知的微生物特異基因序列，才能得出結果。因此，16S rRNA序列分析法在微生物的鑒定上優于傳統微生物鑒定。

當前，16S rRNA序列分析法的應用主要是以下方面：揭示自然界微生物的多樣性，研究微生物生態學，研究與工、農業和環保相關的微生物種類，診斷醫學微生物的分子。對其在醫學微生物分子診斷中的應用進行總結發現，其主要是鑒定與人類健康相關的未知細菌，研究人體不同組織環境中的微生物多樣性，臨床上快速診斷致病微生物。

4 結束語

綜上所述，16S rRNA序列分析法在醫學微生物鑒定中應用效果明顯，但作為當前研究熱點，還需要不斷地深入研究，挖掘更多的方法和應用性，進而更好地為人們服務。

[1] 張志明，孫海英，李建平，等.16S rRNA在醫學微生物鑒定中的應用[J].國際檢驗醫學雜志，2010，31（4）：349-350.

[2] 邵美云，李園園，岳昌武，等.抗多種病原微生物菌株的分離與鑒定[J].貴州農業科學，2014，（7）：88-92.

[3] 沈亞娟，夏云.16S rRNA基因序列分析鑒定非典型細菌的實驗研究[J].重慶醫學，2013，42（1）：46-48.

[4] Michelow I C，Olsen K，Lozano J，et al.Diagnostic utility and clinical significance of naso-and oropharyngeal samples used in a PCR assay to diagnose Mycoplasma pneumoniae infectiom in children with community acquired pneumonia[J].J Clin Microbiol，2004，42（7）：3339-3341.

[5] 徐鳴皋，丁進亞，徐娟，等.兩種全自動微生物鑒定系統在布魯菌鑒定中的應用比較[J].現代檢驗醫學雜志，2015，（4）：105-107.

[6] 王艷萍.16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因間區在微生物鑒定中的應用[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34（8）：994-996.

[7] 朱飛舟，陳利玉，陳漢春，等.16S rRNA基因序列分析法鑒定病原細菌[J].中南大學學報（醫學版），2013，（10）：1035-1041.

[8] 何艷霞，向詩非，李澆，等.基于16S rRNA和rpoB基因的分子系統發育分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應用[J].微生物學雜志，2016，36（4）：27-35.

Application of 16S rRNA Sequence Analysis in Medical Microbiological Identificatio

Zhang Ling-ling

Objective：To study the effect of 16S rRNA sequence analysis in medical microbiological identification.Methods：38 patients with pneumonia treated in our hospital from January 2016 to January 2017 were enrolled in this study.All patients were treated with 16S rRNA and traditional microbiological methods.Serum test results were used as gold standard，and two methods were compared.Application Effect in Microbial Identification.RESULTS：Of the 38 patients，37（97.3%）of mycoplasma pneumoniae and 16S rRNA sequence analysis showed that the sensitivity was 92.1% higher than that of the traditional microbiological examination and 72.8% in the microbiological examination.The false positive rate was 7.9% lower than that of the traditional microbiological examination 34.2%（P＜0.05），and the detection time was shorter than that of the traditional microbiological examination.Conclusion：16S rRNA sequence analysis is effective in the detection of medical microbes，with high detection accuracy and application value.

16S rRNA；sequence analysis；medical microbial identification

R372

B

1003-6490（2017）12-0178-02

2017-10-16

張玲玲（1988—），女，河南周口人，講師，主要研究方向為病原微生物。