去甲腎上腺素對原代培養大鼠心肌細胞的凋亡率及相關蛋白的影響

馬艷霞,郭 政(山西醫科大學麻醉學系,太原 03000;山西醫科大學學報編輯部)

去甲腎上腺素對原代培養大鼠心肌細胞的凋亡率及相關蛋白的影響

馬艷霞1,2,郭 政1
(1山西醫科大學麻醉學系,太原 030001;2山西醫科大學學報編輯部)

目的 觀察去甲腎上腺素(NE)對體外培養的原代新生大鼠心肌細胞凋亡率及相關凋亡蛋白的影響。 方法 選用出生1-3 d的SD大鼠建立原代培養新生大鼠心肌細胞模型。將培養72 h的心肌細胞隨機分為對照組(未使用任何藥物)與不同濃度NE組(分別采用10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE),每組3孔(n=3)。加藥后3 h采用流式細胞術測定心肌細胞凋亡率;采用Western blot檢測CryAB及Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比值的變化。 結果 與對照組比較,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE作用下心肌細胞凋亡率均出現顯著升高(均P<0.05);CryAB表達下降(均P<0.05),Bcl-2表達下降(除10-8mol/L組外均P<0.05)、Bax表達升高(除10-7mol/L組外均P<0.05),Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05)。 結論 去甲腎上腺素可能通過降低CryAB、Bcl-2表達，升高Bax表達,降低Bcl-2/Bax比值，誘導體外原代培養大鼠心肌細胞的凋亡率增加。

凋亡; 心肌細胞; 去甲腎上腺素; αB晶體蛋白; Bcl-2; Bax

細胞凋亡廣泛存在于生理和病理情況下,心肌缺血、心肌梗死及心力衰竭等多種心血管疾病的病理過程均有心肌細胞凋亡的發生[1,2],但各種疾病狀態下細胞凋亡的機制尚未完全闡明。細胞凋亡的過程受到多種因素的影響。作為交感神經的主要神經遞質之一,去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)在生理濃度下的作用為正性變時、變力、變傳導,但是其在病理情況下可以引起細胞凋亡[3,4]。因此,NE的作用可能與其濃度有關。

細胞凋亡的過程涉及因子眾多,而因子間的相互作用決定了細胞最終是否發生凋亡。Bcl-2家族與熱休克蛋白家族是細胞凋亡過程中發揮重要作用的兩大家族。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比例與細胞是否發生凋亡關系密切[5,6],研究細胞凋亡時檢測Bcl-2/Bax的比值變化至關重要。αB-晶狀體蛋白(CryAB)在眼晶狀體、心肌及骨骼肌等組織中均有豐富表達[7],其在成年心肌可溶性蛋白量中的比例占1%-3%[8],在心肌中具有重要的生理功能[9]。多項研究表明,CryAB與凋亡的關系密切[10-12]。但是NE與CryAB之間的關系尚不清楚。

為進一步闡明NE與心肌細胞凋亡及相關凋亡蛋白之間的關系,本研究采用體外原代培養的乳鼠心肌細胞模型,通過觀察不同劑量去甲腎上腺素對心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及其比值以及CryAB的影響,為探討心肌細胞凋亡的可能機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇出生1-3 d的SD大鼠,雌雄不拘,購自山西醫科大學實驗動物中心。去甲腎上腺素為上海禾豐制藥有限公司產品;凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀為美國BD公司產品。DMEM培養液購自美國Gibco公司,無菌膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司。兔抗Bcl-2抗體、CryAB一抗均為美國Abcam公司產品。GAPDH、Bax一抗為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 原代培養新生大鼠心肌細胞模型的制備

參照相關研究的原代細胞體外培養方法[13]制備新生大鼠心肌細胞模型。取出生1-3 d的SD大鼠,無菌操作取出心臟,以1 g/L的無菌膠原酶Ⅱ(質量/體積)消化后制成細胞懸液,在37 ℃、含5%CO2的培養箱中孵育70 min,計數后接種于6孔培養板。采用DMEM培養液孵育細胞。每24 h換液一次,待培育夠72 h時選擇生長狀態及同步搏動良好的心肌細胞用于后續實驗。

1.3 實驗分組

取18孔培養72 h的心肌細胞隨機分為對照組(不加任何干預藥物)與終濃度為10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L的NE組,每組n=3。NE作用3 h,采用流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡率,采用Western blot的方法檢測CryAB及Bcl-2、Bax表達及Bcl-2/Bax比值的變化。

1.4 流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡率

細胞凋亡率檢測的操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。主要步驟:藥物作用3 h,吸去上清,0.25%胰蛋白酶37 ℃作用3-5 min,終止消化并收集細胞,離心5 min(1 000 r/min),PBS洗滌,再次離心5 min(1 000 r/min)。重懸細胞。取100 μl細胞懸液,先后加入5 μl FITC與5 μl PI,混勻,室溫避光孵育15 min。稀釋至500 μl,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot的方法檢測CryAB及Bcl-2、Bax的表達

采用Western blot的方法檢測各組CryAB及Bcl-2、Bax的表達變化。主要操作步驟參考劉濤等[14]的方法并加以改進:提取總蛋白并采用BCA法進行蛋白濃度測定,據此計算上樣量。電泳條件:濃度4%的積層膠60 V,濃度10%的分離膠150 V。采用PVDF膜進行蛋白轉膜,CryAB一抗的濃度為1 ∶2 000,Bcl-2一抗,Bax一抗及GAPDH一抗的濃度均為1 ∶500。HRP二抗濃度為1 ∶1 500。ECL發光法顯影并成像。采用Quantity One圖像分析軟件進行分析。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度NE作用3 h心肌細胞凋亡率的變化

與對照組比較,10-8-10-4mol/L NE組凋亡率均升高,差異均有統計學意義(均P<0.05);10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE組間兩兩比較,除10-8與10-4mol/L NE組間、10-7與10-6mol/L NE組間比較差異無統計學意義外,其余各組間兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.05,見圖1)。

與對照組比較，*P<0.05；與10-8mol/L NE組比較，#P<0.05；與10-7mol/L NE組比較，▽P<0.05；與10-6mol/L NE組比較，▼P<0.05；與10-5mol/L NE組比較，☆P<0.05圖1 不同濃度NE作用3 h心肌細胞凋亡率的變化Figure 1 Changes of apoptosis of cardiomyocytes after treated with different concentrations of NE for 3 h

2.2 NE對心肌細胞中CryAB的影響

10-8-10-4mol/L NE組心肌細胞中CryAB含量較對照組均下降,且差異有統計學意義(均P<0.05);但是不同濃度NE組間CryAB含量兩兩比較,差異無統計學意義(P>0.05,見圖2)。

圖2 不同濃度NE作用3 h心肌細胞中CryAB的變化Figure 2 Changes of CryAB in cardiomyocytes after treated with different concentrations of NE for 3 h

2.3 NE對心肌細胞中Bcl-2、Bax及其比值的影響

除10-7mol/L NE組外,與對照組比較，10-8,10-6,10-5,10-4mol/L NE組心肌細胞中Bcl-2含量均下降,差異均有統計學意義(均P<0.05);但10-8-10-4mol/L NE組組間兩兩比較,差異無統計學意義(P>0.05，見圖3)。

除10-8mol/L NE組外,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE組Bax含量均升高,與對照組間的差異均有統計學意義(均P<0.05);不同濃度(10-8-10-4mol/L)NE組間兩兩比較,差異無統計學意義(均P>0.05，見圖3)。

與對照組比較,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE組的Bcl-2/Bax比值均下降(均P<0.05),但不同濃度組間差異無統計學意義(P>0.05，見圖3)。

3 討論

3.1 去甲腎上腺素與心肌細胞凋亡

心臟接受包括交感神經在內的多重神經支配。急性心肌缺血、急性心肌梗死、急性心衰等心臟急性事件發生時,局部心肌收縮功能障礙,加上疼痛、焦慮等精神因素的作用,可以誘發心臟交感神經活性增強,產生兒茶酚胺類神經遞質的濃度升高。去甲腎上腺素作為兒茶酚胺類神經遞質,其在生理濃度下(約10-9mol/L)[15]的作用為使心率加快,心臟房室交界的傳導加快,心肌收縮能力增強,每搏功增加。但病理狀態下,大量NE合成、釋放對心肌細胞具有直接和間接的毒性作用,甚至導致心肌細胞凋亡及致死性心律失常。

圖3 不同濃度NE作用3 h心肌細胞Bcl-2、Bax及其比值的表達變化Figure 3 Changes of Bcl-2, Bax expression and Bcl-2/Bax in cardiomyocytes after treated with different concentrations of NE for 3 h

Communal等[16]于1998年首次應用成年大鼠心肌細胞培養模型,證實NE的毒性效應與心肌細胞凋亡有關。此后,陳吉等[3]、Shyu[4]等均采用不同方法研究證實,NE可以誘導心肌細胞的凋亡。但是不同研究者采用的NE的濃度及藥物作用時間不同,且NE引起凋亡的機制尚未完全闡明。因此,本研究結合相關研究結果,選擇10-8-10-4mol/L作為藥物作用濃度,觀察NE作用3 h對心肌細胞凋亡率的影響。結果表明,不同濃度NE(10-8-10-4mol/L)均能誘導體外培養的新生大鼠心肌細胞凋亡率的上升。

3.2 αB-晶狀體蛋白與心肌細胞凋亡

αB-晶狀體蛋白(CryAB)屬于熱休克蛋白家族的一員,其在心肌組織中含量豐富且具有重要的生理功能[9]。許多熱休克蛋白可作用于凋亡信號通路的不同環節發揮抗凋亡作用。CryAB也可與多種細胞因子結合,通過多種途徑發揮抗凋亡作用[[11,12,17]。本研究采用Western blot的方法研究NE誘導3 h后心肌細胞中CryAB的表達變化情況,結果表明,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L的NE作用3 h,均可引起心肌細胞CryAB蛋白的表達下降,不同濃度NE組間CryAB的表達差異無統計學意義(均P>0.05)。本研究結果與孫韜[18]的研究結果一致。因此高濃度的NE可以引起心肌細胞凋亡率增加,CryAB表達下降。結合CryAB的抗凋亡作用,我們推測,CryAB在拮抗NE引起的心肌細胞凋亡中發揮一定的作用,但是具體機制如何,還有待進一步研究。

3.3 Bcl-2家族與心肌細胞凋亡

Bcl-2家族成員眾多,起抗凋亡作用的Bcl-2和促凋亡作用的Bax是其中兩個最具代表性的成員。細胞凋亡的信號轉導途徑有多種,線粒體途徑是其中最重要的途徑之一[19]。Bcl-2家族成員能夠通過調節線粒體膜上通透性轉換孔(MPTP)的開啟與關閉對細胞凋亡產生影響[19]。Bcl-2蛋白可以使MPTP的功能保持正常。而一些Bax蛋白在凋亡誘導因素作用下可與Bcl-2形成異源二聚體,抑制Bcl-2的活性,使MPTP不可逆開放,啟動和維持細胞凋亡的線粒體途徑。Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的比例以及它們之間相互作用形成同源或異源二聚體的傾向決定了細胞生存或死亡的命運[20]。因此檢測Bcl-2與Bax的比值非常重要。本研究采用Western blot的方法研究心肌細胞中Bcl-2與Bax的表達情況,結果表明,不同濃度NE作用下均能誘導原代培養的心肌細胞中Bcl-2表達與Bcl-2/Bax比值下降,Bax表達升高,不同濃度NE之間蛋白表達量雖有波動,但是差異并無統計學意義。

Mao等[21]研究發現,人αB晶體蛋白可以通過與Bcl-2家族的相互作用起到抗凋亡作用。αB晶體蛋白可以與促凋亡因子結合,抑制Bax與Bcl-XS從胞質到線粒體的轉位,保護線粒體的完整性,從而發揮抗凋亡的作用。結合本研究結果,我們推測,在高濃度的NE作用下,細胞凋亡程序開始啟動,但同時也觸發一些抗凋亡蛋白如CryAB的抗凋亡程序的啟動。但是在高濃度NE作用下,CryAB始終處于低水平的表達狀態,使得最終Bcl-2表達降低而Bax表達升高,Bcl-2/Bax比值下降,促凋亡作用占優勢,最終引起細胞凋亡。

本研究結果表明,不同濃度(10-8-10-4mol/L)的NE均可誘導體外原代培養的心肌細胞凋亡率升高,它可能通過抑制抗凋亡蛋白CryAB、Bcl-2表達,升高促凋亡蛋白Bax表達而實現。心肌細胞的凋亡過程涉及多種蛋白的參與,Bcl-2、Bax及CryAB都只是其中的一個因素,各個因素之間的共同作用以及優勢蛋白的性質決定了細胞的最終結局,而各細胞因子之間的具體關系值得進一步深入探討。

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Effectsofnorepinephrineonapoptosisofculturedratcardiomyocytesandexpressionofrelatedapoptoticproteins

MA Yanxia1,2,GUO Zheng1
(1DepartmentofAneasthesiology,ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001,China;2EditorialDepartmentofJournalofShanxiMedicalUniversity)

ObjectiveTo investigate the effects of norepinepherine(NE) on the apoptosis rate of cultured rat cardiomyocytes and the changes of the related apoptotic proteins.MethodsThe neonatal cardiomyocytes from the new-born Sprague-Dawley rats(1-3 days of age) were isolated and cultured. The cardiomyocytes incubated for 72 h were used for further experiments. Eighteen wells of the cultured cardiomyocytes were randomly divided into 6 groups(3 wells in each group): control group(without NE) and five NE groups(treated with 10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE respectively). The apoptosis rate of the cardiomyocytes were examined by flowcytometry(FCM). The expression of Bcl-2, Bax and αB-crystallin in cultured cardiomyocytes were detected by Western blot.ResultsThe apoptosis rate of the cardiomyocytes in NE graups(10-8-10-4mol/L)were significantly higher than that in control group(allP<0.05). The expressions of Bcl-2 and αB-crystallin were significantly decreased after treated with NE(P<0.05),while Bax was significantly increased(P<0.05),and the value of Bcl-2/Bax decreased significantly(P<0.05).ConclusionNE could induce the apoptosis by increasing the expression Bax,decreasing the level of Bcl-2, αB-crystallin and the ratio of Bcl-2 to Bax in cultured cardiomyocytes.

apoptosis; cardiomyocytes; norepinephrine; alpha B crystalline; Bcl-2; Bax

山西省青年科技研究基金資助項目(2015021183);山西醫科大學博士啟動基金資助項目(03201425)

馬艷霞,女,1980-06生,博士,編輯

2017-10-15

R363

A

1007-6611(2017)12-1213-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.002