乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3、Th17細胞、CD4+Treg細胞的變化及意義

王 玲,蔚梅芳,武希潤(山西省榮軍醫院內科,太原 000;洛陽市中心醫院消化科;山西醫科大學第二醫院消化科;通訊作者,E-mail:xirunwu66@6.com)

乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3、Th17細胞、CD4+Treg細胞的變化及意義

王 玲1,蔚梅芳2,武希潤3*
(1山西省榮軍醫院內科,太原 030031;2洛陽市中心醫院消化科;3山西醫科大學第二醫院消化科;*通訊作者,E-mail:xirunwu66@163.com)

目的 檢測乙肝肝硬化患者外周血中25-(OH)D3、Th17、CD4+Treg細胞變化,為維生素D治療乙肝肝硬化提供依據。 方法 選取乙肝肝硬化患者21例,正常對照者15例,采用電化學發光免疫測定法檢測25-(OH)D3水平,采用流式細胞儀檢測Th17細胞、CD4+Treg細胞水平,并計算Th17/Treg比率。 結果 健康對照組外周血25-(OH)D3為(31.87±5.97)ng/ml,乙肝肝硬化組25-(OH)D3明顯降低,為(11.89±6.04)ng/ml,兩者相比差異具有統計學意義(t=9.510,P=0.001)。與健康對照組相比,乙肝肝硬化組外周血Th17細胞百分比(0.913%±0.216%vs2.498%±2.583%)增高,CD4+Treg細胞百分比降低(3.964%±1.116%vs2.333%±1.714%),Th17/Treg比率(1.199±0.973vs0.256±0.138)增高,差異均有統計學意義(P<0.05)。 結論 乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3水平顯著降低,Th17增高,CD4+Treg降低,存在CD4+Treg、Th17、Treg/Th17免疫平衡紊亂,增加外周血25-(OH)D3水平有可能調節乙肝肝硬化患者體內CD4+Treg、Th17、Treg/Th17變化,改變其免疫狀態。

乙肝肝硬化; 25-羥維生素D3; CD4+Treg細胞; Th17細胞

肝硬化是慢性肝病進行性發展的結果,在我國以乙肝肝硬化最多見,占肝硬化病因66%。正常情況下,CD4+T細胞亞群,CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)和輔助T細胞17(T helper type 17 cell,Th17)在維持機體免疫平衡方面發揮重要作用,Thl7/Treg和Thl/Th2處于相對穩定的免疫平衡狀態中。Thl/Th2免疫平衡失調導致HBV不能被宿主完全清除是病情遷延不愈、出現慢性肝損傷的主要原因,Th17/Treg的免疫平衡失調與HBV相關急慢性肝衰竭的免疫損傷和HBV再感染有關[1]。維生素D(VitD)是重要的雙向免疫調節劑,具有免疫調節、抗炎及抗纖維化等作用。25-(OH)D3能夠調節CD4+、CD8+細胞數量及比例,上調Th2細胞和Treg細胞的活性,抑制Th1和Th17細胞的活性,促進CD4+T細胞分化時偏向Th2[2]。然而,VitD、Th17、CD4+Treg細胞在乙肝肝硬化發病中的作用及其相互關系研究少有報道。本研究著重檢測乙肝肝硬化患者的外周血25-(OH)D3、Th17、Treg細胞水平變化,旨在為25-(OH)D3臨床應用于乙肝肝硬化治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例選擇2015-04～2015-09在山西醫科大學第二醫院明確診斷為乙肝肝硬化病人(肝硬化組)21例,其中男13例,女8例,年齡29-74歲,中位年齡59歲。健康對照組15例來自2015-06～2015-12山西醫科大學第二醫院體檢中心,其中男7例,女8例,年齡39-72歲,中位年齡58歲。

1.2 方法

抽取空腹靜脈血6-8 ml,加入肝素抗凝,取3-3.5 ml人外周血淋巴細胞分離液加入10 ml的滅菌離心管中,分離外周血單個核細胞(PBMC),調整細胞數為1×106/ml。淋巴細胞表面染色、洗滌、破膜、胞內染色,進行Treg細胞、Th17細胞標記,流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用LSD-t檢驗,P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3變化

乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3水平較對照組明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

組別n25?(OH)D3tp健康對照組1531 87±5 979 5100 001肝硬化組 2111 89±6 04

2.2 乙肝肝硬化患者外周血Th17細胞、CD4+Treg細胞、Th17/Treg細胞變化

乙肝肝硬化患者外周血Th17細胞增多,CD4+Treg細胞減少,Thl7/Treg細胞比值增高,表現為Thl7/Treg細胞失衡,與健康對照組相比差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

組別nTh17(%)Treg(%)Th17/Treg 健康對照組150 913±0 2163 964±1 1160 256±1 138 肝硬化組 212 498±2 5832 333±1 7141 199±0 973 t-2 5203 141-3 950 P<0 05<0 05<0 05

3 討論

肝硬化患者體內也存在免疫功能紊亂,有研究表明,Th17細胞的數量與肝損傷標記水平密切相關[3]。具有強大促炎效應的Th17細胞通過IL-17/IL-17R信號途徑直接激活肝星狀細胞,而激活的肝星狀細胞分泌大量促炎性細胞因子加劇肝臟炎癥反應,加速肝硬化的進程。Treg細胞通過分泌細胞因子TGF-β或細胞間直接接觸作用于肝星狀細胞[4,5],抑制特異性T細胞的免疫反應,維持免疫耐受。國內外許多研究[6-9]表明,慢性乙型肝炎患者外周血中Th17細胞、Treg細胞水平均明顯升高,在HBV感染過程中,Treg細胞及其高表達的轉錄因子FoxP3共同抑制HBcAg誘導的Th17細胞亞群的增殖、分化,造成Th17/Treg比例的失衡[10],Th17/Treg免疫平衡被打破會進一步加快肝硬化的進程,進而加大罹患肝癌的風險[11]。

保持Th17/Treg的免疫平衡可以有效維持免疫應答的正常狀態,但Th17/Treg免疫平衡狀態與乙肝肝硬化發生發展的關系尚不清楚。在4周、8周和12周四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠模型體內,Th17細胞數增加,但Treg細胞數逐漸減少[12]。Yu等[13]發現,在乙肝肝硬化尤其是失代償期患者體內,IL-10、IL-23、IL-17、TGF-β都明顯升高,TGF-β/IL-17、Th17/Treg比率升高,提示Th17/Treg免疫平衡失調可能通過HSC激活促進肝纖維化及肝硬化進程。本研究中,乙肝肝硬化組外周血Th17細胞水平高,Treg細胞水平低,Th17/Treg比率高,提示乙肝肝硬化存在Th17、Treg、Th17/Treg免疫紊亂,免疫抑制效應減弱而免疫炎性效應增強誘導了外周血T細胞亞群的紊亂以及外周免疫耐受的破壞,有可能促進肝硬化的發生、發展。

近年來研究表明,在慢性肝病,尤其是肝硬化患者,存在VitD缺乏[14]。本研究通過檢測乙肝肝硬化患者體內的25-(OH)D3水平發現,其25-(OH)D3水平較對照組明顯降低,且差異有統計學意義(P<0.05)。

越來越多的研究表明,VitD是免疫調節劑,與免疫調節有關。25-(OH)D3缺乏與丙肝肝硬化嚴重的肝細胞壞死及肝纖維化密切相關[15]。Gal-Tanamy等[16]研究表明VitD通過誘導IFN-γ和MxA基因表達抑制人類肝細胞丙型肝炎病毒(HCV)復制,并增強VitD受體表達,產生協同抗病毒治療作用,最終可能延緩或阻止丙肝肝硬化進展。Treg細胞有效抑制了過強的免疫反應,及時阻止肝細胞的持續損傷,但同時也阻止了機體清除HBV的能力,使乙型肝炎感染慢性化。1,25-(OH)2D3被轉運到靶組織中結合VitD受體后進行信號轉導,直接或間接作用于淋巴細胞,抑制T淋巴細胞的增殖、分化,抑制Th17細胞分泌促炎細胞因子IL-17[16]。VitD對T細胞也有一定的刺激作用,T細胞受刺激后可以表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)和FoxP3,從而誘導Treg細胞產生[17]。本實驗結果表明,肝硬化患者25-(OH)D3明顯降低,Th17細胞增加,Treg細胞降低、Th17/Treg增加,推測25-(OH)D3缺乏打破了Th17/Treg免疫平衡,參與乙肝肝硬化發生、發展。

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Alterationsof25-hydroxyvitaminD3,Th17cellsandCD4+TregulatorycellsinperipheralbloodinpatientswithhepatitisBcirrhosis

WANG Ling1,YU Meifang2,WU Xirun3*
(1DepartmentofInternalMedicine,ShanxiRongjunHospital,Taiyuan030031,China;2LuoyangCentreHospital,HenanProvince;3DepartmentofGastroenterology,SecondHospitalofShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:xirunwu66@163.com)

ObjectiveTo explore the alterations of 25-hydroxyvitamin D3,Th17 cells and CD4+T regulatory cells in peripheral blood of patients with hepatitis B cirrhosis.MethodsTwenty-one patients with hepatitis B cirrhosis and 15 healthy volunteers were enrolled in the study. Electrochemical luminescence immunoassay was used to detect the level of 25-hydroxyvitamin D3.The Th17 cell and CD4+Treg cells in the peripheral blood mononuclear cell were detected by flow cytometry.ResultsCompared with normal controls [(31.87±5.97)ng/ml], the peripheral blood 25-hydroxyvitamin D3 concentrations decreased significantly in patients with hepatitis B cirrhosis[(11.89±6.04)ng/ml,t=9.510,P=0.001]. The percentage of Th17 cells was higher in patients with hepatitis B cirrhosis than that of normal controls(2.498%±2.583%vs0.913%±0.216%). In hepatitis B cirrhosis patients, the percentage of CD4+Treg cells was lower than that of healthy controls(2.333%±1.714%vs3.964%±1.116%). Compared with normal controls,the ratio of Th17/Treg increased in patients with hepatitis B cirrhosis(0.256±0.138vs1.199±0.973,P<0.05).ConclusionIn patients with hepatitis B cirrhosis,the peripheral blood 25-hydroxyvitamin D3 concentration decreases, Th17 cells increases, CD4+Treg cells decreases and the ratio of Th17/Treg increases. There are the immune disorders of CD4+Treg cells, Th17 cells and the ratio of Treg/Th17 in hepatitis B cirrhosis patients. Increased peripheral blood level of 25-hydroxyvitamin D may adjust immune status of hepatitis B cirrhosis.

liver cirrhosis; 25-hydroxyvitamin D3; CD4+Treg cells; Th17 cells

王玲,女,1968-12生,學士，副主任醫師,E-mail:983095232@qq.com

2017-11-19

R512.6

A

1007-6611(2017)12-1233-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.007