卡博替尼抵抗產單核細胞李斯特菌感染的體內實驗研究

肖 晴,龍 敏，劉一帆(廣州醫科大學附屬第三醫院檢驗科,廣州 5055;南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院微生物學系;廣州醫科大學附屬第五醫院；通訊作者,E-mail:longmin@smu.edu.cn；共同通訊作者,E-mail:48840@qq.com)

卡博替尼抵抗產單核細胞李斯特菌感染的體內實驗研究

肖 晴1,龍 敏2*，劉一帆3#
(1廣州醫科大學附屬第三醫院檢驗科,廣州 510515;2南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院微生物學系;3廣州醫科大學附屬第五醫院；*通訊作者,E-mail:longmin@smu.edu.cn；#共同通訊作者,E-mail:2482840@qq.com)

目的 探究卡博替尼抗產單核細胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)感染的作用。 方法 24只6周齡C57BL/6小鼠隨機分為不同劑量卡博替尼組,每組6只,腹腔注射LM菌液后,分別灌胃給予0,10,15,20 μg/g卡博替尼,比較四組小鼠肝脾細菌載量。另將6周齡C57BL/6小鼠隨機分為卡博替尼組、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)組、卡博替尼和Amp聯合用藥組以及PBS對照組,腹腔注射LM菌液后,分別灌胃給予卡博替尼20 μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20 μg/g、灌胃卡博替尼20 μg/g后腹腔注射20 μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS,比較四組小鼠的生存曲線、肝脾細菌載量以及肝臟病理改變。 結果 隨著卡博替尼劑量增加,肝脾細菌載量逐漸降低,其中20 μg/g劑量組相比PBS組,肝脾細菌載量顯著降低(P<0.01);卡博替尼單獨用藥組小鼠相比PBS對照組小鼠,生存率較高、肝臟和脾臟的細菌載量較低(P<0.05)、肝臟炎癥病變程度輕,聯合用藥組比卡博替尼單獨用藥組小鼠的肝脾細菌載量均顯著降低(P<0.05)。 結論 體內實驗研究結果提示卡博替尼具有抵抗產單核細胞李斯特菌感染的作用。

卡博替尼; 產單核細胞李斯特菌; 小鼠

產單核細胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種對人類致病的胞內寄生菌,它廣泛分布于自然界,如土壤、污水、屠宰場、青飼料、食品生產加工器具及多種食品,動物和人體也可帶有此菌[1]。LM可引起人和動物多種李斯特菌病,包括敗血癥、腦炎、腦膜腦炎等,特別是孕婦以及免疫缺陷者。

目前治療LM感染大多依賴于抗生素的應用,曲伐沙星、阿莫西林等抗生素雖然可以在一定程度上抵抗細胞外LM感染,但是對細胞內LM感染作用極其有限[2,3]。LM引起的細胞內感染仍然是醫學上一個嚴峻的挑戰,其主要原因是藥物無法進入細胞內殺菌和相對忽視了宿主的抗菌機制。因此,發展新型抗胞內感染藥物是目前亟待解決的醫學問題之一。

LM重要毒力因子-內化素B(internalin B,InlB)是一種侵襲蛋白,大小約67 kDa,屬于內化素蛋白家族,可模擬天然宿主細胞配體肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF),特異性結合HGF/SF受體(HGF/SF-R或c-Met),激活與細菌內吞相關的c-Met介導的信號級聯放大,誘發細菌內吞[4]。卡博替尼(cabozantinib)是一種口服的多種受體酪氨酸激酶抑制劑,美國食品藥品管理局(FDA)已批準卡博替尼用于轉移性甲狀腺髓樣癌的[5]。本研究擬運用動物體內模型,驗證c-Met抑制劑卡博替尼對李斯特菌體內感染的阻斷作用,探討卡博替尼作為LM感染治療藥物的可行性。

1 材料和方法

1.1 菌株和主要試劑

采用的產單核細胞李斯特菌ATCC株13932(血清型4b)由美國南加州大學keck醫學院血液和感染性疾病系提供;卡博替尼(XL-184)購自美國Santa公司;氨芐青霉素(Amp)購自美國Sigma;其他試劑均購自廣州鼎國生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

6周齡雌性C57BL/6小鼠,SPF級,體質量18-22 g,購買于南方醫科大學動物實驗中心(SYXK(粵)2016-0167)。

1.3 菌株培養

將產單核細胞李斯特菌劃線接種于BHI固體培養基，37 ℃恒溫培養16 h，挑取單一菌落于BHI液體培養基中37 ℃、180 r/min振蕩培養2代，再重新接種于新鮮的BHI液體培養基中，搖至對數生長期，10 000 r/min離心1 min，用高壓滅菌PBS洗滌3次，然后稀釋菌液至5×106CFU/ml備用。

1.4 不同劑量卡博替尼處理的肝脾活菌計數

取24只小鼠,隨機分為不同劑量卡博替尼組:0,10,15,20 μg/g,每組各6只。每組小鼠腹腔注射產單核細胞李斯特菌菌液100 μl(5×106CFU/ml),在給菌前2 h和給菌后的第24小時分別灌胃給予相應劑量的卡博替尼。給菌后的第48小時,給予小鼠10%水合氯醛200 μl,麻醉后無菌打開其胸腔,暴露心肺,用1 ml注射器從心尖處抽取200 μl血液,然后用剪刀或針尖刺破心臟右心耳,并從心尖處注入30 ml預冷PBS,直到小鼠肺部變白為止,說明體循環灌注沖洗效果良好。取其肝臟和脾臟。一半組織稱重后,加入1 ml PBS研磨成勻漿,倍比梯度稀釋后,涂布于BHI固體培養基中，放入37 ℃恒溫培養箱中過夜，次日計數平板菌落數，計算出各組小鼠肝臟、脾臟中的活菌數。另一半肝臟組織固定于10%甲醛中，4 ℃保存，HE染色以進行組織病理學檢查。48 h內死亡小鼠立即解剖取其肝、脾。

1.5 小鼠生存曲線分析

將36只小鼠隨機分為4組:卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯合氨芐青霉素組、PBS對照組,每組各9只,每只小鼠腹腔注射1×106CFU LM,并分別在感染后第6,12,24小時給藥,卡博替尼組小鼠灌胃給予卡博替尼20 μg/g,氨芐青霉素組小鼠腹腔注射氨芐青霉素20 μg/g、聯合用藥組小鼠灌胃卡博替尼20 μg/g后腹腔注射20 μg/g氨芐青霉素,對照組小鼠腹腔注射等量PBS。每天記錄觀察小鼠的臨床癥狀和生存情況,共5 d。

1.6 肝臟HE染色

采集的肝臟組織于10%甲醛固定后,經水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、貼片、烤片、HE染色、封片后,于顯微鏡下進行病理觀察。

1.7 卡博替尼與Amp 協同作用分析

取24只小鼠,隨機分為卡博替尼組、Amp組、卡博替尼+Amp組、PBS組,每組各6只。每組小鼠腹腔給予產單核細胞李斯特菌菌液100 μl(5×106CFU/ml),分別在感染后第2,6,24小時給藥,給藥方式同1.4,給菌后第48小時無菌取其肝、脾進行活菌計數。48 h內死亡小鼠,于死亡2 h內解剖。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 卡博替尼的抑菌作用

解剖小鼠,取其肝脾進行活菌計數。結果顯示,隨著卡博替尼劑量增加,肝脾細菌量有所減少,15 μg/g劑量組和20 μg/g劑量組相比于PBS對照組,肝臟細菌載量均顯著降低[(5.78±0.28)log10CFUvs(8.28±0.20)log10CFU,P<0.001;(4.33±0.29)log10CFUvs(8.28±0.20)log10CFU,P<0.01], 脾臟細菌載量也顯著減少[(4.24±0.45)log10CFUvs(7.35±0.30)log10CFU,P<0.01;(4.08±0.27)log10CFUvs(7.35±0.30)log10CFU,P<0.01,見圖1]。

組間比較,**P<0.01,***P<0.001圖1 不同劑量卡博替尼處理的肝、脾細菌載量Figure 1 Liver and spleen bacterial loads in different dosage groups of cabozantinib

2.2 小鼠生存率比較

注射1×106CFU LM后第12小時,PBS組個別小鼠開始出現明顯的發抖、蜷縮、抱團等臨床癥狀,食欲下降,精神萎靡,給菌后24 h內死亡3只小鼠,5 d內共死亡7只小鼠,120 h內小鼠生存率為22.3%;卡博替尼組小鼠在給菌后24 h內死亡3只小鼠,之后無小鼠死亡,比對照組小鼠的生存率明顯增加,達到66.7%;氨芐青霉素單獨用藥組生存率為88.9%;卡博替尼聯合氨芐青霉素組小鼠的生存率為100%(見圖2)。

圖2 各組生存曲線比較Figure 2 Comparison of survival curve among four groups

2.3 肝臟病理觀察

取卡博替尼處理組和PBS組小鼠肝臟進行HE染色,結果顯示PBS組小鼠肝臟出現大量中性粒細胞浸潤,水腫,且有明顯的膿腫組織,炎癥程度比較嚴重,而卡博替尼組小鼠肝臟未見明顯的炎性粒細胞,未出現水腫,炎癥變化較輕(見圖3)。

2.4 卡博替尼聯合Amp的抑菌作用

把小鼠分為PBS組、卡博替尼組、Amp組以及卡博替尼和Amp聯合用藥組,解剖小鼠后,取其肝脾勻漿計數,結果顯示卡博替尼組肝臟細菌載量顯著低于PBS組[(4.68±0.99)log10CFUvs(7.71±0.45)log10CFU,P<0.05],聯合用藥組肝臟細菌載量亦明顯低于卡博替尼單獨用藥組[(0.66±0.66)log10CFUvs(4.68±0.99)log10CFU,P<0.05],差異具有統計學意義;且聯合用藥組相比卡博替尼組,脾臟細菌載量顯著減少[(0.41±0.41)log10CFUvs(3.98±0.82)log10CFU,P<0.05，見圖4],表明卡博替尼與氨芐青霉素聯合用藥可增強對LM感染的抵抗作用。

A.卡博替尼組 B. PBS組圖3 卡博替尼處理后肝臟病理變化(10×40)Figure 3 Pathological changes of the liver tissues after treatment with cabozantinib(10×40)

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖4 卡博替尼聯合氨芐青霉素用藥下肝脾細菌載量Figure 4 Changes of liver, spleen bacterial loads after treated with cabozantinib and ampicillin

3 討論

產單核細胞李斯特菌入侵宿主細胞是通過“拉鏈式”機制,即細胞表面配體與宿主細胞膜受體結合,激活胞內信號通路,造成肌動蛋白骨架重排引發細胞膜對細菌的漸進包裹吞噬,介導該過程的李斯特菌表面配體為內化素(internalin,Inl),其中Inl A和Inl B是非吞噬細胞內化所必需的內化素,為LM所特有。Inl B與宿主細胞膜肝細胞生長因子(HGF-R/Met)結合后,誘發胞內酪氨酸位點磷酸化,促進信號級聯放大誘導細菌內吞[6]。目前,針對包括LM在內的細胞內感染菌,宿主介導地抑制細胞信號通路激活的抗菌治療方法日益廣泛[7-9]。在人類腫瘤的形成和轉移過程中,c-Met被異常激活所產生的異常信號是最常見的改變之一,c-Met介導的信號傳導通路在LM入侵宿主細胞過程中同樣重要[10]。c-Met抑制劑卡博替尼已獲PDA批準用于多種臨床疾病的治療[11，12],作為可能的新型抗菌藥物具有兩個優點,一方面卡博替尼是一種小分子抑制劑,可以穿過血腦屏障,在治療LM引發的中樞神經系統感染上很有優勢。另一方面,InlB是LM侵入細胞所必需的。

LM早期能通過腸道屏障進入深層組織,并迅速轉移至淋巴結、肝臟和脾臟中,轉移的數量與感染的數量成正比,肝臟和脾臟中LM細菌載量可以反應機體感染LM的程度,而Inl B在LM定植肝脾過程中,起著重要作用,靶向InlB介導的侵襲對于發展特異性阻斷LM細感染的新型治療手段非常重要[13]。卡博替尼可以阻斷InlB與c-Met的結合,因此在一定程度上可降低肝脾中LM的細菌載量。本研究表明,隨著卡博替尼劑量增加,肝脾細菌量逐漸降低,說明卡博替尼能夠抵抗產單核細胞李斯特菌在肝脾的定植。而比較不同處理組小鼠的生存率、肝脾細菌載量以及肝臟病理變化,結果顯示:卡博替尼組、Amp組、卡博替尼+Amp組三組小鼠的生存率較PBS組高;注射卡博替尼的小鼠肝脾細菌量顯著地低于對照組;通過肝臟HE染色結果可以判斷,卡博替尼能夠減輕肝臟的炎性病變。目前青霉素類抗生素是治療LM胞內感染的首選藥物,可阻斷細菌肽聚糖的合成從而抑制細胞外細菌的生長,而卡博替尼可阻斷LM與細胞表面受體的結合,阻止細菌進入細胞,而LM是一種胞內寄生菌,故卡博替尼和青霉素的聯合使用會降低LM對宿主細胞的感染。本研究的數據顯示卡博替尼和氨芐青霉素聯合使用,其肝脾細菌量最少,在一定程度上證明了卡博替尼能夠協同抗生素治療LM感染,具有一定的臨床使用價值。

綜上所述,本研究通過體內試驗證明了卡博替尼能抵抗產單核細胞李斯特菌在肝脾的定植,并與氨芐青霉素聯合使用可增強對LM的抑菌作用,對研究新型治療胞內細菌感染的藥物具有一定積極作用。

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ExperimentalstudyoncabozantinibagainstinfectioncausedbyListeriamonocytogenesinmice

XIAO Qing1, LONG Min2*, LIU Yifan3#
(1ClinicalLaboratory,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofMicrobiology,SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine,SouthernMedicalUniversity;3FifthAfficiatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:longmin@smu.edu.cn;#Co-correspondingauthor,E-mail:2482840@qq.com)

ObjectiveTo explore the effect of cabozantinib on the infection of Listeria monocytogenes(LM).MethodsThe 24 6-week-old mice(C57BL/6) were randomized into four groups(n=6 each) and treated with 0,10,15,20 μg/g cabozantinib by intragastric injection after intraperitoneal injection of LM,respectively, and then the bacterial counts in liver and spleen were compared among four groups. The 6-week-old mice were randomized into cabozantinib group, ampicillin(Amp) group, combination group and PBS control group, and were respectively treated with cabozantinib(20 μg/g) by intragastric injection, Amp(20 μg/g) by intraperitoneal injection, cabozantinib in combination with Amp, and equal PBS by intraperitoneal injection after intraperitoneal injection of LM. And then the survival curve,the number of bacteria in liver and spleen and pathological changes of liver tissue were compared.ResultsThe bacterial load in liver and spleen was decreased gradually with the increase of cabozantinib. And the bacteria load in liver and spleen was lower in 20 μg/g cabozantinib group than in PBS group(P<0.01). The survival rate was higher and the bacterial load in liver and spleen was lower in 20 μg/g cabozantinib group than in PBS group(P<0.05), and the pathological changes was lighter. The bacterial load in liver and spleen in combination group was lower than that in cabozantinib group(P<0.05).ConclusionThe vivo experiment indicates that cabozantinib could resist the infection of LM.

cabozantinib; Listeria monocytogenes; mice

肖晴,女,1990-05生,碩士,初級檢驗技師,E-mail:972740185qq.com

2017-06-02

R446.5

A

1007-6611(2017)12-1255-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.012