糖尿病患者血漿減少α-突觸核蛋白的磷酸化和寡聚化

鄭凇楊 李 昕,3,4 楊巍巍,3,4 李旭冉 李旭穎 于文嬌 于 順,3,4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；3.帕金森病北京市重點實驗室和教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053；4.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

·Alpha-突觸核蛋白的致病機(jī)制·

糖尿病患者血漿減少α-突觸核蛋白的磷酸化和寡聚化

鄭凇楊1,2李 昕1,2,3,4楊巍巍1,2,3,4李旭冉1,2李旭穎1,2于文嬌1,2于 順1,2,3,4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；3.帕金森病北京市重點實驗室和教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053；4.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

目的研究2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)患者血漿對α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)磷酸化和寡聚化聚集的影響。方法收集首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院內(nèi)分泌科T2D住院患者70例，另收集年齡和性別與之匹配的健康志愿者70例作為對照組。采集抗凝血，并分離血漿。將基因重組人α-Syn在患者和對照志愿者血漿中振蕩孵育，ELISA法檢測各組人群血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量。結(jié)果T2D患者血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量較對照組均有顯著降低(P<0.05)，且其與年齡有相關(guān)性。結(jié)論T2D患者血漿以年齡依賴的方式減少寡聚化和磷酸化α-Syn的形成。

α-突觸核蛋白；2型糖尿病；血漿；磷酸化；寡聚化

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)是糖尿病的主要類型，占糖尿病患者的90%以上。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)通常指胰島素介導(dǎo)的葡萄糖利用率降低，又稱胰島素敏感性下降。目前認(rèn)為，IR在糖尿病發(fā)病機(jī)制中起重要作用，并伴隨著糖尿病發(fā)生、發(fā)展的全過程。

α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是一個由140個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于神經(jīng)元的突觸前末梢。目前認(rèn)為，異常聚集的α-Syn對神經(jīng)元具有毒性作用，并在神經(jīng)退行性疾病尤其是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)中起關(guān)鍵作用[1-3]。已知α-Syn的聚集受磷酸化修飾的影響，且磷酸化修飾的α-Syn聚集體是PD標(biāo)志性病理變化路易體(Lewy body,LB)的主要成分。有研究[4]顯示，在上千例患者血液樣本的研究中，隨著患者血清內(nèi)源性α-Syn水平的降低，IR指標(biāo)升高。此外，在對α-Syn缺乏的小鼠模型進(jìn)行IR的飲食誘導(dǎo)過程中，小鼠機(jī)體表現(xiàn)為葡萄糖代謝障礙。利用葡萄糖鉗夾實驗[5-6]顯示，α-Syn基因敲除小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)過程中，脂肪組織和骨骼肌表現(xiàn)為嚴(yán)重的胰島素抵抗。鑒于上述研究發(fā)現(xiàn)，筆者推測糖尿病機(jī)體由于IR造成的內(nèi)環(huán)境改變可能不利于α-Syn的磷酸化和聚集，這一內(nèi)環(huán)境變化也可能反映到患者的血漿中。因此，本研究觀察T2D患者血漿對α-Syn寡聚化和磷酸化的影響及分析這一作用與糖尿病指標(biāo)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

從2015年7月至10月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的T2D患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)(1999年)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。選取70例T2D患者，其中男40例，女30例，年齡46 ～ 70歲。另選取年齡、性別相匹配的70例健康志愿者作為對照組，其中男40例，女30例，年齡44 ～ 70歲。所有的受試者均接受綜合生化檢測項目，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗，詳見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)進(jìn)行。所有受試者在進(jìn)行抽血前均被告知實驗研究目的與研究方案，并簽署知情同意書。

表1 兩組研究對象資料比較Tab.1 Detailed data with control group and type 2 diabetes group

1.2 材料

重組人α-Syn、抗α-Syn單克隆抗體(3D5)由本室制備；抗Ser129抗體(Santa Cruz公司，美國)；生物素化的3D5(康為世紀(jì)標(biāo)記)；親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(Vector公司，美國)；4-硝基磷酸二鈉鹽(pNPP)(Sigma公司，美國)；ELISA 96孔酶標(biāo)板(Corning公司，美國)；酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)。

1.3 方法

1) 血漿中α-Syn寡聚體形成量的ELISA檢測[8]：向血漿中加入重組人α-Syn，使其濃度為100 μmol/L，37 ℃ 280 r/min恒溫震蕩48 h。用終濃度為1 μg/mL的3D5單抗包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，PBST洗板。10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA封閉，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板。加入倍比稀釋的重組人α-Syn(0.5、0.25、0.125、 0.062 5、0.031 25、0 mol/L)和待測樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板。加入生物素化的3D5(1 μg/mL)100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板。再加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(1: 5 000),37 ℃孵育1 h，PBST洗板，最后加入pNPP 100 μL/孔，37 ℃顯色30 min，405 nm處測定吸光度值。每次每個樣品重復(fù)3孔，重復(fù)3次。

2)血漿中磷酸化α-Syn形成量的ELISA檢測：用終濃度為0.1 μg/mL的抗Ser129抗體包被96孔酶標(biāo)板，其余步驟同上。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量檢測

如圖1所示，T2D組血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量均較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(n=70,P<0.05)。

圖1 2型糖尿病患者與對照者血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量比較Fig.1 Formation of oligomeric and phosphorylatedα-syn in plasmas of type 2 diabetes and control subjects

Statistical analysis of oligomeric α-Syn (A) and phosphorylated α-Syn (B) formation in plasma of type 2 diabetes and control subjects.*P<0.05vscontrol.n=70;T2D: type 2 diabetes;O-α-Syn: α-synuclein oligomers;P-α-Syn: phosphorylated α-synuclein.

2.2 T2D血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量與糖尿病指標(biāo)的相關(guān)性分析

如圖2所示，T2D血漿中磷酸化α-Syn水平與年齡有相關(guān)性(圖2B)(r=0.261，P=0.029)；寡聚化α-Syn水平與年齡沒有相關(guān)性(圖2A)(r=0.114，P=0.380)；糖尿病病程分別與T2D血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn水平(圖2C，D)無明顯相關(guān)性(r值分別為0.126和0.122，P值分別為0.318和0.278)；空腹血糖分別與T2D血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn水平(圖2E，F(xiàn))無明顯相關(guān)性(r值分別為0.002和0.105，P值分別為0.985和0.485)；糖化血紅蛋白分別與T2D血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn水平(圖2G，H)無明顯相關(guān)性(r值分別為0.045和0.084，P值分別為0.734和0.491)。

3 討論

該研究利用本實驗室建立的ELISA方法檢測受試者血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn的形成量，研究顯示T2D患者血漿中上述兩指標(biāo)的水平較對照組明顯降低，其降低機(jī)制尚不明確。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是一種促進(jìn)α-Syn去磷酸化的酶[9]，有文獻(xiàn)[10-11]指出，游離脂肪酸可以提高其活性，加速α-Syn去磷酸化，從而降低磷酸化α-Syn形成量，并進(jìn)一步影響α-Syn寡聚體的形成。

本實驗還顯示，T2D患者血漿中磷酸化α-Syn的形成量與年齡呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)[12-15]報道，代謝類疾病的發(fā)病率隨著年齡增加顯著增長，并且老化伴隨著各種各樣的生理改變，例如線粒體功能障礙、炎性反應(yīng)發(fā)生和胰島素敏感性的下降，這些改變最終加劇神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。盡管上述相關(guān)性機(jī)制尚不清楚，但本課題組推測，年齡是影響T2D患者血漿中磷酸化α-Syn形成的重要因素，且具有增齡性。相比之下，α-Syn寡聚體的形成量與年齡的相關(guān)性不明顯。已知α-Syn蛋白磷酸化修飾參與了α-Syn聚集形成寡聚體的過程[16]，且α-Syn的聚集也受磷酸化修飾的影響[17-18]，因此本室推測寡聚體形成較磷酸化α-Syn滯后可能是其與年齡相關(guān)性不明顯的原因。此外，其余糖尿病指標(biāo)與本實驗測試的兩指標(biāo)無相關(guān)性，即其余糖尿病指標(biāo)對T2D血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量的改變影響不大。

總之，本研究顯示T2D患者血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn的形成量較健康者明顯降低。這不但反映了T2D患者血漿對寡聚化和磷酸化α-Syn形成的影響，也為T2D對神經(jīng)元退變的影響提供了新的線索。

圖2 2型糖尿病患者血漿中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量與糖尿病指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between formations of oligomeric and phosphorylated α-Syn and diabetic indexes

Correlation between formations of oligomeric α-Syn and phosphorylated α-Syn and age (A,B),diabetes duration (C,D),FPG (E,F),HbA1c (G,H).P-α-Syn in T2D patients was positively correlated with age.Other parameters and the formations of o-α-Syn and p-α-Syn in T2D patient plasma were not explicitly linked to each other.T2D: type 2 diabetes;O-α-Syn: α-synuclein oligomers;P-α-Syn: phosphorylated α-synuclein;FPG: fasting plasma glucose;HbA1c: hemoglobin A1c.

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Decreasedα-synucleinphosphorylationandoligomerizationintheplasmaofpatientswithtype2diabetes

Zheng Songyang1,2,Li Xin1,2,3,4,Yang Weiwei1,2,3,4,Li Xuran1,2,Li Xuying1,2,Yu Wenjiao1,2,Yu Shun1,2,3,4*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofGeriatrics,Beijing100053,China;2.ClinicalCenterforParkinson’sDisease,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;3.BeijingKeyLaboratoryforParkinson’sDiseaseandKeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseases,MinistryofEducation,Beijing100053,China;4.NationalClinicalResearchCenterforGeriatricDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveTo investigate the effect of the plasma of patients with type 2 diabetes (T2D) patient on the formation of oligomeric and phosphorylated α-synuclein (α-Syn).MethodsA total of 70 hospitalized patients with T2D and 70 age-and sex-matched healthy control subjects were recruited.Blood plasmas were collected and recombinant human α-Syn was incubated with the plasma.ELISA was used to measure the levels of oligomeric and phosphorylated α-syn formed in the plasma.ResultsThe levels of oligomeric and phosphorylated α-syn in the plasma of T2D patients were significantly lower than those in the plasma of healthy controls (P<0.05),which was positively correlated with age.ConclusionCompared with control plasma,the plasma from T2D patients decreases α-syn oligomerization and phosphorylation in an age-dependent manner.

α-synuclein;type 2 diabetes;plasma;phosphorylation;oligomerization

國家自然科學(xué)基金(81371200,81071014,81401042)，北京市醫(yī)院管理局“使命”計劃專項經(jīng)費資助(SML20150803)；北京市科學(xué)技術(shù)委員會資助(Z161100005116011，Z171100000117013)；北京市衛(wèi)生和計劃生育委員會“老年重大疾病關(guān)鍵技術(shù)研究”(PXM2017_026283_000002)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81371200,81071014,81401042);Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Mission Plan (SML20150803);Beijing Municipal Science &Technology Commission (Z161100005116011，Z171100000117013);Beijing Municipal commission of Health and Family Planning (PXM2017_026283_000002).

*Corresponding author，E-mail：yushun103@163.com

時間：2017-12-13 20∶53

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2053.012.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.020]

R338

2017-10-23)

編輯 陳瑞芳